论文研究目标及其意义
这篇发表在《Angewandte Chemie》杂志上的文章，主要研究了一种名为FasV的黄素依赖型卤化酶（Flavin-dependent halogenase，FDH）在Naphthacemycin生物合成过程中的作用机制。Naphthacemycin是一类含Naphthacene骨架的芳香族聚酮类天然产物（Naphthacene-containing aromatic polyketide），具有多个卤素取代基，在抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）方面有潜在的药用价值。文章旨在阐明FasV是如何实现Naphthacemycin骨架上多个位点的卤化修饰的，这对于开发新型卤化酶催化剂和合成多卤代芳香族化合物具有重要意义。
Naphthacemycins are a group of aromatic polyketide featuring a distinctive naphthacene skeleton, undergoes poly-substitution through chlorination and has been reported for its ability to inhibit protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B).
研究多位点卤化酶的催化机制，不仅有助于理解自然界是如何实现复杂天然产物的生物合成，也为利用生物催化手段制备新颖卤代化合物提供了思路。文章指出，目前已上市的小分子药物中有25%含有卤素，农用化学品中更是高达80%，可见卤素在调节分子性质和生物活性方面的重要作用。因此，开发高效、高选择性的卤化酶催化剂，对医药和农化等产业发展具有重要推动意义。
研究思路与方法创新
本文在研究思路和方法上主要有以下几点创新：
从Naphthacemycin的生物合成基因簇（BGC）出发，鉴定出一种新型的多位点卤化酶FasV，并通过异源表达和体外酶学实验，证实其能催化Naphthacemycin骨架上多达5个位点的氯代反应。与已报道的卤化酶不同，FasV能在空间上相距较远（>8Å）的不同芳香环上引入卤素。
FasV not only completely consumed substrate 1, but also yielded a penta-chlorinated product 10 with low yield (Figure 2A, viii, and S5).
创新性地结合时程分析（Time-course assays）、**酶动力学（Enzyme kinetics）**和计算机模拟等多种手段，阐明了FasV催化Naphthacemycin 氯代的顺序和区域选择性规律。研究发现，FasV 主要通过3条平行路径实现连续的多位点氯代，其中R5、R3和R2位是优先修饰的位点。 >To explore the mechanism of FasV, which can catalyze the halogenation of multiple sites, we first need to determine whether the five chlorinations occurred sequentially or in a disordered manner. While the incubation of FasV with substrates 2, 3, 5, and 8, it was observed that they exhibited a consistent product profile based on HPLC analysis (Figure 2Bi–iv).
通过X射线晶体学解析了FasV与底物复合物的晶体结构，并结合分子对接和突变分析，鉴定出一系列关键氨基酸残基（T53、L81、F93和I212等），初步阐明了它们在调控FasV 底物识别和区域选择性方面的作用机制。
Examination of the FasV crystal structure unveiled its affiliation with the conventional FDHs family, evident from the FAD binding domain and the simultaneous presence of the active amino acid K76. The overall structure of FasV consists of 18 β-strands and 12 α-helices (Figure 4A).
提出了一种新颖的"双重活化"催化机制。通过分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）计算发现，除了常见的K76参与的N-Cl活性物种形成外，E49和S50可能协同活化底物上的酚羟基，降低反应能垒。这一机制对多位点卤化酶的理性设计提供了新思路。 >Based on these comprehensive discussion, we propose an advanced double activation mode for multi-site halogenases. Specifically, under the action of FADH2 , the chlorination atom forms HOCl, which binds to K76, creating the N−Cl species. Subsequently, as the side chain of residues oscillates, the carboxyl group of E49 approaches the hydroxy group of S50, resulting in a distance between the two groups that can be shortened to 2.7 Å (Figure 6A), then S50 activates the substrate by transferring a proton to E49, thereby reducing the activation energy required for the reaction.
关键结果分析
本文通过系统的实验与分析，在多位点卤化酶催化机制的研究方面取得了一系列重要发现，主要包括以下几点：
鉴定出一种高效的五元氯代酶FasV
作者从Naphthacemycin的生物合成基因簇出发，鉴定出一种新颖的黄素依赖型多位点卤化酶FasV。通过异源表达和体外酶学实验发现，FasV能在底物1上连续引入5个氯原子，催化活性明显高于同工酶如NatC和ForV等。这突破了目前已知卤化酶的修饰能力。
FasV not only completely consumed substrate 1, but also yielded a penta-chlorinated product 10 with low yield (Figure 2A, viii, and S5).
阐明了FasV催化多位点氯代的顺序规律
作者巧妙地结合时程分析、酶动力学等手段，系统考察了FasV对不同氯代中间体的催化效率，由此提出FasV主要通过3条平行路径实现五元连续氯代的新机制（Scheme 1）。其中，R5位是各路径的起始位点，R3和R2位是后续优先修饰的位点。这一发现填补了对多位点卤化酶反应顺序的认知空白。
Based on these mutation experiments, we have determined that T53, L81, F93, and I212 are essential for substrate binding and play a crucial role in enabling FasV to exhibit regioselectivity in generating the corresponding polychlorinated products.
揭示了关键氨基酸残基对FasV选择性的调控作用
通过X射线晶体学解析了FasV的高分辨率结构（2.0 Å），并辅以分子对接和定点突变分析，鉴定出T53、L81、F93和I212等残基在调控底物结合和区域选择性方面的重要作用。尤其是I212T突变体，仅能催化单个位点（R5）的氯代，而丧失了多位点修饰能力（图4）。这为后续设计高选择性卤化酶奠定了结构基础。
Examination of the FasV crystal structure unveiled its affiliation with the conventional FDHs family, evident from the FAD binding domain and the simultaneous presence of the active amino acid K76. The overall structure of FasV consists of 18 β-strands and 12 α-helices (Figure 4A).
提出了"双重活化"的新颖催化机制
借助分子动力学模拟和密度泛函理论计算，作者提出FasV可能采用一种"双重活化"机制来降低氯代反应能垒（图6）。其中，除了常见的K76参与的N-Cl活性物种生成外，E49和S50可协同活化底物酚羟基，进一步稳定过渡态。这一机制对多位点卤代酶的理性设计具有重要启示作用。
>Based on these comprehensive discussion, we propose an advanced double activation mode for multi-site halogenases. Specifically, under the action of FADH2, the chlorination atom forms HOCl, which binds to K76, creating the N−Cl species. Subsequently, as the side chain of residues oscillates, the carboxyl group of E49 approaches the hydroxy group of S50, resulting in a distance between the two groups that can be shortened to 2.7 Å (Figure 6A).
初步拓展了FasV的底物适用范围
在对Naphthacemycin类化合物的催化基础上，作者进一步考察了FasV对其他含酚羟基化合物的氯代能力。结果表明，FasV能以较高转化率实现对化合物12上邻位酚羟基的选择性二元氯代（图6B）。这表明FasV具有一定的底物普适性，为后续开发FasV衍生的生物催化剂奠定了基础。
This reaction with the extended substrate further supports the novel mechanism we proposed. Specifically, the mechanism relies not only on the unique amino acids of the multi-site halogenase but also on the essential role of the phenolic hydroxy structure.
研究方法的系统性与创新性
本文在研究FasV催化机制时，综合运用了酶学表征、晶体学、突变分析、动力学模拟等多种手段，多角度、全方位地剖析了FasV的结构与功能，实验数据与理论分析相互印证，逻辑严谨，论证充分。这些方法所形成的研究范式，对于阐明其他复杂酶促反应机制具有很好的借鉴意义。
小结
本文在多位点卤化酶催化机制的研究方面取得了多项原创性发现，主要包括：鉴定出一种新颖的五元氯代酶FasV，阐明了其催化Naphthacemycin骨架连续多位点氯代的反应顺序和区域选择性，揭示了关键氨基酸残基的调控作用，并提出了"双重活化"的新型催化模型。这些发现极大地丰富了对卤化酶结构与功能多样性的认识，为后续开发基于FasV骨架的生物催化剂以及指导卤代天然产物的合成生物学制备奠定了重要基础。
研究成果的影响和应用前景
本文在多位点卤化酶催化机制方面取得了系统性认识，并提出了"双重活化"催化模型，为后续开发新型卤代酶分子工具奠定了基础。此外，文章还初步探索了FasV在不同底物上的催化潜力（图6B），表明基于FasV骨架改造的卤化酶有望应用于更广泛的含酚羟基化合物的卤代反应。总的来看，本研究主要有以下几点影响：
丰富了卤化酶结构与功能的多样性认识，为挖掘和设计新型卤化酶提供理论指导。特别是揭示了多位点卤化的顺序规律和选择性调控机制，加深了对卤代反应的理性认识。 证实了FasV在催化复杂底物多位点卤代反应的优异性能，有望成为潜在的生物催化剂。结合定向进化等蛋白工程手段，未来可开发出底物适用范围更广、选择性更高的FasV衍生物。 >Proteins with larger binding pockets generally exhibit a broader substrate spectrum. In line with this, we explored the utilization of FasV to catalyze a substrate with a distinct skeleton. As expected, substrate 12 underwent two halogenations at the ortho position of the phenolic hydroxy group with high conversion, catalyzed by FasV, yielding compound 13 (Figure 6B), which was characterized by HRMS and NMR data (Figures S30–S37). This reaction with the extended substrate further supports the novel mechanism we proposed.
为合成含卤素的芳香族聚酮类天然产物及其类似物提供了新的生物合成策略。利用基因工程手段调控FasV等卤化酶的表达，有望实现药物先导化合物的定向生物合成，加速药物研发进程。 文章所开发的研究方法，如结合时程分析、酶动力学、晶体学与计算模拟等，为研究其他复杂酶促反应提供了很好的范例，具有一定的示范意义。
本文在多位点卤化酶催化机制的研究方面取得了多项原创性发现，主要包括：鉴定出一种新颖的五元氯代酶FasV，阐明了其催化Naphthacemycin骨架连续多位点氯代的反应顺序和区域选择性，揭示了关键氨基酸残基的调控作用，并提出了"双重活化"的新型催化模型。这些发现极大地丰富了对卤化酶结构与功能多样性的认识，为后续开发基于FasV骨架的生物催化剂以及指导卤代天然产物的合成生物学制备奠定了重要基础。
未来研究方向与挑战
基于本文的研究成果，未来在卤化酶及其催化反应领域，还有以下一些值得深入探索的问题：
进一步厘清E49、S50等关键残基在双重活化中的作用机制，并挖掘影响区域选择性的其他结构基础。这需要开展更多的定点突变和动力学实验，并辅以计算模拟分析。 考察FasV及其突变体在更多芳香族化合物，特别是药物分子骨架上的催化性能，评估其作为工业生物催化剂的应用潜力。这可能催生出卤代药物合成与先导化合物优化的新技术。 研究FasV与底物、辅因子的结合动力学和构象变化规律，阐明多位点卤代的分子识别机制。这可借助快速动力学、单分子FRET、NMR等技术，并结合分子模拟手段来实现。 利用定向进化、理性设计等蛋白工程策略，创制出底物适用范围更广、区域选择性更高、催化效率更高的FasV突变酶。这需要建立高通量筛选平台，并引入机器学习算法指导突变位点选择。 整合宿主基因组编辑、代谢工程等合成生物学手段，构建高效的FasV催化体系，实现卤代芳香族化合物的定向生物合成。这可能催生出卤代试剂绿色合成等新的商业化方向。
Biosyn导师：唐功利
https://sioc.cas.cn/sklcb/rcdw/kydw/yjy/202409/t20240902_7331641.html
唐功利男
职 称：研究员
学 历：研究生
电 话：021-54925113
职 务：课题组长
传 真：021-64166128
电子邮件：gltang@mail.sioc.ac.cn
个人网页：http://tanggl.sioc.ac.cn
通信地址：上海市零陵路345号
个人简历
1994年毕业于南开大学，获环境化学学士学位，1999年获中国科学院上海有机化学研究所生物有机化学博士学位，毕业后赴美国加州大学化学系进行博士后研究，2001-2003年在美国威斯康辛大学药学院任研究助理。2003年被聘为中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室研究员。
研究方向
1) 天然产物生物合成研究：以微生物来源的结构新奇、活性显著的复杂天然产物为目标分子，从基因和蛋白水平揭示自然界神奇的生物化学过程，理解其中蕴涵的新型酶催化反应和生理拮抗机制；在此基础上一方面通过化学-生物相结合的策略来创造“非天然”天然产物，另一方面通过生物合成与生物信息相关联的方法激活沉默基因簇，进而发现新的天然产物。
2) 复杂天然产物类药物的高效制备：以生物合成途径为基础，采用微生物代谢工程或合成生物学的方法和策略致力于提高目标化合物的产量，改变发酵产物的组份及产生新化合物；进而通过与化学半合成或生物催化相结合发展高效的制备路线。
3) 抗肿瘤天然产物的化学生物学研究：利用优化的噬菌体展示克隆或与生物合成相关联的策略筛选、发现一些高活性天然产物的生物靶分子，进而研究其生物活性的机理。
获奖及荣誉
2004年获得国家杰出青年基金
2005年入选上海市科技启明星计划
2008获上海市启明星跟踪计划资助
2014年入选上海市优秀学术带头人，同年入选科技部中青年科技创新领军人才
2015年入选国务院特殊津贴专家
2016年入选万人计划-中青年科技创新领军人才，同年入选上海市领军人才。
