研究目标与问题意义
本文旨在阐明固氮酶在氧化应激下由FeSII蛋白介导的构象保护机制。固氮酶是生物固氮过程的关键酶,负责将大气中的氮气还原为氨,但其对氧气极度敏感。许多固氮生物生活在有氧环境中,因此必须进化出机制来保护固氮酶免受氧气损伤。先前的研究发现,在氧化应激下,一种名为FeSII的[2Fe:2S]铁氧还蛋白能够与固氮酶结合形成氧气保护复合物。然而,关于FeSII介导的构象保护机制的分子基础仍不清楚。阐明这一机制对于理解生物固氮如何适应有氧环境、提高固氮效率具有重要意义。
正如文中所述:
To counter O2 damage to nitrogenase, diazotrophs use O2 scavengers, exploit compartmentalization or maintain high respiration rates to minimize intracellular O2 concentrations. A last line of damage control is provided by the 'conformational protection' mechanism, in which a [2Fe:2S] ferredoxin-family protein termed FeSII (ref. 10) is activated under O2 stress to form an O2-resistant complex with the nitrogenase component proteins. Despite previous insights, the molecular basis for the conformational O2 protection of nitrogenase and the mechanism of FeSII activation are not understood.
新思路、方法与模型
本研究利用冷冻电镜技术,首次解析了由FeSII蛋白与固氮酶组分(1钼铁蛋白MoFeP、2铁蛋白FeP)形成的核心复合物的高分辨率结构。主要发现包括:
FeSII通过广泛的蛋白-蛋白相互作用将MoFeP和FeP连接在一起,使其金属簇处于催化失活但氧气保护状态。
FeSII mediates an extensive network of interactions with MoFeP and FeP to position their iron–sulphur clusters in catalytically inactive but O2-protected states.
这种三蛋白复合物可进一步聚合形成长丝状结构。
The architecture of the FeSII–nitrogenase complex is confirmed by solution studies, which further indicate that the activation of FeSII involves an oxidation-induced conformational change.
FeSII作为氧化还原开关,其还原电势设定了FeSII激活的阈值,从而调控复合物的装配。
FeSII is a redox-based conformational switch whose reduction potential sets a trigger threshold of Ethreshold = −260 mV in diazotrophic bacteria.
借助冷冻电镜,本研究能够直接观察FeSII-固氮酶复合物的高分辨率结构,为理解构象保护机制提供了关键线索。而先前只能通过生化和遗传学实验间接推断其作用机制。SAXS、EPR等溶液研究进一步揭示了FeSII的氧化还原状态如何调控其构象变化和复合物装配。
贮氮气单胞菌FeSII-固氮酶复合物的冷冻电镜结构揭示了氧气保护机制
1. 冷冻电镜揭示FeSII-固氮酶形成不同聚合状态的复合物
作者利用冷冻电镜技术,在O2暴露条件下观察到FeSII与固氮酶形成不同聚合状态的复合物,包括V形的2:2:1 MoFeP:FeP:FeSIIdimer核心复合物以及由其进一步聚合形成的长丝状结构(图1a):
The cryo-EM images of these samples (Fig. 1a and Extended Data Figs. 1 and 2) revealed a heterogenous mixture of small, discrete particles (5–10 nm in dimensions); intermediate, V-shaped species (approximately 20–30 nm); and long, zigzag-shaped filaments (up to 150 nm in length) (Fig. 1a).
相比之下,在厌氧条件下则未观察到类似复合物的形成(Extended Data Fig. 2b)。这表明FeSII-固氮酶复合物的形成依赖于O2暴露。
分析型超速离心实验进一步表明,FeSII-固氮酶复合物的组成和分布随蛋白浓度变化而变化(图1b):
The broadness of the analytical ultracentrifugation (AUC) peaks may be attributed to the population of oligomers/polymers of different compositions (see Extended Data Fig. 3a for peak analyses). Doubling the total protein concentration led to an increase in the population of the 29 S assembly at the expense of the 12.2 S and 20 S complexes (Fig. 1b, blue trace, and Extended Data Fig. 3a), whereas halving the total protein concentration resulted in a decreased amount of the 20 S complex and a complete de-population of the 29 S species (Fig. 1b, orange trace, and Extended Data Fig. 3a).
图1
这些结果突破了先前对FeSII-固氮酶复合物组成和动态性认识的局限,揭示了其聚合状态的多样性和浓度依赖性,为理解FeSII介导的构象保护机制奠定了结构基础。
2. 2.27 Å分辨率冷冻电镜结构揭示FeSII-固氮酶相互作用的分子细节
通过对O2暴露样品的冷冻电镜数据进行处理,作者解析了2:2:1 MoFeP:FeP:FeSIIdimer核心复合物的原子分辨率结构(图2,分辨率2.27 Å):
Despite its small size, the FeSII homodimer mediates an extensive network of protein–protein interactions that interconnects two FeP and two MoFeP molecules at the vertex (Fig. 2), acting as a macromolecular glue. Each of the symmetry-related ε1- and ε2-subunits of FeSII forms sizeable interfaces with both γ1- and γ2-subunits of an FeP molecule (total buried surface area (BSA) ≈ 1,800 Å2) and both the α1- and β1-subunits of a MoFeP molecule (BSA ≈ 2,700 Å2) (Fig. 2a–f).
高分辨率结构清晰展现了FeSII、MoFeP和FeP之间广泛而紧密的相互作用界面。这一发现解释了为何三者缺一不可,只有同时存在才能形成稳定的、具有氧气保护功能的复合物。先前的生化实验只能推测三者之间存在相互作用,但缺乏直接的结构证据。
图2
结合先前的突变体研究,高分辨率结构还揭示了FeSII中多个关键残基(如K15、K16、H56等)在维持其核心结构以及与MoFeP和FeP相互作用中的作用(Extended Data Fig. 6):
Corroborating these functional effects (but not necessarily the predictions on their cause), we find Lys15, Lys16 and His56 to be involved in extensive intra- and intersubunit interactions that seem to be crucial in stabilizing the core structure of FeSII and the ε1–ε2-homodimer interface (Extended Data Fig. 6a–c).
这些结果将先前对FeSII关键残基的生化表征与其在复合物中的结构角色直接关联起来,加深了对FeSII分子机制的理解。
3. 复合物结构揭示FeSII如何介导固氮酶的氧气保护
冷冻电镜结构清晰展现了FeSII如何通过构象重排,将FeP的[4Fe:4S]簇与MoFeP的P-簇和FeMoco簇相隔离,使其处于催化失活但氧气保护状态(图3):
首先,FeSII对FeP的[4Fe:4S]簇起到直接的屏蔽作用(图3b):
The steric protection of the [4Fe:4S] cluster is provided exclusively by the C-terminal tail (residues 118–122) of FeSII (Fig. 3b), which packs closely against the cluster to create a water-free environment.
其次,FeSII可能通过其R24残基阻碍O2对MoFeP的P簇的可及性(图3c,d):
The Arg24 sidechain of FeSII stretches over the αβ-subunit interface of MoFeP at a surface position right above the P-cluster, potentially providing a steric block against O2 access to the cluster (Fig. 3c,d).
图3
此外,FeSII还可能通过增强MoFeP的αIII结构域的刚性,减少FeMoco的溶剂可及性(图2h):
In addition, the αIII domain of MoFeP that forms a lid above FeMoco is buttressed against both FeSII and FeP (Fig. 2h), which may decrease the mobility of this domain and prevent possible O2 access to FeMoco.
这些结果从原子水平揭示了FeSII介导固氮酶氧气保护的多重机制,突破了先前只停留在推测阶段的认识瓶颈。作者创造性地将复合物结构与先前的生化线索相结合,系统阐明了FeSII作为分子屏障和构象调控因子的作用机理。
4. FeSII-固氮酶复合物具有内在的氧化还原敏感性
基于FeSII-固氮酶复合物结构,作者进一步分析了其内在的氧化还原敏感性。EPR实验表明,在三元复合物中,还原态FeP与氧化态FeSII之间可以发生快速电子传递(图3e, Extended Data Fig. 7):
Interestingly, when the incubation time before sample freezing was increased to 5 min, we detected FePto-FeSII electron transfer even in the absence of MoFeP (Extended DataFig. 7c). We thus conclude that FeP and FeSII are capable of forming an electron transfer-active binary complex in solution, which is further supported by the population of an approximately 95 kDa species within the mixture of chemically oxidized FeP, MoFeP and FeSII (Extended Data Fig. 3b). Yet, the efficiency of FeP-to-FeSII electron transfer is considerably increased when MoFeP is also present, consistent with the stabilization of the electron transfer-active FeP–FeSII docking geometry through the formation of the ternary 2:2:1 complex.
SAXS和圆二色谱实验证实,FeSII在氧化和还原状态下具有不同的构象和寡聚状态(图3f, Extended Data Fig. 3c,d):
The Kratky profile of the oxidized FeSII sample is consistent with the structure of the FeSII homodimer within the 2:2:1 complex (χ2 = 1.3) (Extended Data Fig. 8c) as well as with the closed conformation previously characterized by crystallography (χ2 = 1.4) (Fig. 3f). The scattering profile of the DT-reduced FeSII differs considerably from that of the oxidized protein (Fig. 3f), confirming the existence of an oxidation-dependent conformational switch.
分子模拟进一步预测,氧化态FeSII优先与氧化态FeP和MoFeP形成稳定复合物(Extended Data Fig. 9):
If we conservatively estimate that the reduction potentials of both FeP (Efree,nucleotide-bound = −420 mV) and FeSII (Efree = −260 mV) decrease by 100 mV upon complex formation to −520 mV and –360 mV, respectively, this would indicate that the formation of the 2:2:1 FeSII–nitrogenase complex with oxidized FeP and FeSII would be favoured by a total of 4.6 kcal mol−1 (greater than 3 orders of magnitude change in association constant) over their reduced counterparts.
这些结果突破性地阐明了FeSII-固氮酶复合物装配的氧化还原驱动力,揭示了FeSII作为分子开关感知氧化应激、调控固氮酶活性的新机制。这不仅丰富了人们对固氮生物如何适应有氧环境的认识,也为设计氧化还原调控的蛋白质机器提供了全新思路。
关键结果小结
作者创新性地运用冷冻电镜技术,系统解析了FeSII与固氮酶在氧化应激下形成不同聚合状态复合物的高分辨率结构,并结合生化、光谱学和计算模拟等多种研究手段,从原子水平阐明了FeSII如何通过构象重排,在分子水平上屏蔽和钝化固氮酶活性中心,使其处于一种催化失活但氧气保护的"锁定"状态,直到还原条件重新形成。这一研究填补了人们对FeSII分子机制认识的多个空白,为理性设计和改造耐氧固氮体系奠定了关键的结构和机制基础。同时,FeSII作为氧化还原驱动的分子开关,其结构和功能原理也为开发新型环境响应性蛋白质机器提供了重要启示。
研究成果的影响与应用
本研究阐明了FeSII蛋白作为氧化还原感受器和分子开关,如何通过构象变化和蛋白质组装来保护固氮酶免受氧气损伤。这为理解和改造生物固氮过程提供了新的视角。主要影响包括:
阐明固氮生物如何在有氧条件下维持固氮酶活性,揭示了生物固氮与呼吸、光合作用等有氧代谢的协同进化机制。为设计耐氧固氮系统提供了理论基础。 FeSII介导的可逆构象保护机制有望应用于控制其他对氧敏感的酶和蛋白质。通过类似策略构建氧化还原调控的蛋白质组装体,在生物催化、生物传感等领域具有应用前景。 FeSII-固氮酶复合物的结构为理性设计和改造固氮酶提供了模板。基于对复合物界面的理解,可以定向进化FeSII和固氮酶,以优化其氧气保护能力和催化效率,并扩大固氮酶在非固氮生物中的应用。 本研究证实冷冻电镜可以高分辨率解析易损蛋白质动态复合物,拓展了其在结构生物学和酶学研究中的应用范围。结合其他溶液技术,实现从分子到细胞多层次表征蛋白质机器的功能调控机制。
未来研究方向与展望
基于本研究,FeSII介导的构象保护机制还有以下几个方面值得进一步探索:
氧化应激如何在蛋白和细胞水平动态调控FeSII与固氮酶的相互作用?基因组、蛋白组和代谢组分析有助于从系统层面阐明FeSII-固氮酶相互作用网络的调控机制。 FeSII-固氮酶复合物的形成和解离动力学如何影响固氮效率?高时间分辨的结构生物学和单分子技术有望实时跟踪复合物装配过程,阐明构象保护和固氮催化之间的时空耦合。 除了FeSII,固氮生物中是否存在其他类似的氧化应激感受器?比较基因组和生物信息学分析有助于从进化的角度理解构象保护机制的起源与多样性。 通过定向进化和理性设计优化FeSII-固氮酶相互作用,能否提高固氮酶的耐氧性和催化效率?这需要将计算模拟、基因工程和高通量筛选等技术相结合。 FeSII的分子开关特性能否推广到其他氧化还原敏感酶?基于FeSII-固氮酶复合物的结构基础,可以设计新型氧化还原调控蛋白,用于控制生物催化和信号转导过程。
Biosyn导师：F. Akif Tezcan
http://tezcan.ucsd.edu/index.php/team/
F. Akif Tezcan是加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系的教授,也是材料科学与工程项目和材料发现与设计研究所的成员。他在伊斯坦布尔的德国高中、明尼苏达州圣保罗的麦卡莱斯特学院(化学和生物学学士)以及加州理工学院(与Harry Gray合作的生物无机化学博士)接受教育,之后在加州理工学院作为Helen Hay Whitney研究员(与Doug Rees合作)进行了博士后研究。
他于2005年在加州大学圣地亚哥分校开始了自己的研究项目,主要致力于开发新的化学工具和策略来研究生物固氮过程、设计功能蛋白和酶,以及创造新型蛋白基材料。Tezcan教授在蛋白质化学、生物无机化学和蛋白质材料领域做出了诸多开创性贡献。
他领导的研究小组将化学和生物学的前沿方法相结合,在分子水平上研究和操纵蛋白质的结构与功能。一方面,他们借鉴自然界精妙的蛋白质机器,设计和构建新型金属蛋白,用于催化、传感和能量转换等应用。另一方面,他们利用蛋白质分子之间的特异性相互作用,开发出可编程的蛋白质自组装体系,创制出新颖的超分子蛋白质材料。
此外,Tezcan教授还致力于阐明固氮酶这一重要的生物化学机器的结构与机制。他与合作者率先解析了固氮酶关键中间态的高分辨率结构,并揭示了金属辅因子在其催化过程中的动态变化。本研究中,他们更进一步阐明了FeSII蛋白如何通过构象调控保护固氮酶免受氧气损伤。这些成果极大地加深了人们对固氮过程分子机制的认识。
