研究目标和意义
本文于2024年11月27日在线发表于Nature。研究目标是探究蛋白质相互作用中无序-有序连续体的立体化学效应。具体来说,作者想要解决的问题是:
Whether disordered protein complexes are truly independent of chiral constraints is not clear.
即无序蛋白质复合物是否真正独立于手性限制尚不清楚。这个问题对于产业发展有重要意义,因为:
手性是蛋白质相互作用的重要特征,决定了药物设计和开发的方向。 揭示无序蛋白质复合物的手性依赖性,有助于开发新的治疗策略和药物。 阐明蛋白质演化过程中手性选择的机制,对于合成生物学和生命起源研究具有重要价值。
新思路、方法和优势
本文提出了一个新颖的研究思路,即系统考察蛋白质相互作用无序-有序连续体的手性效应。作者选取了5对具有代表性的蛋白质相互作用体系,覆盖了从完全无序到有序的连续谱(图1c):
We chose as representative examples a set of five interacting protein pairs covering the disorder–order continuum.
图1
与之前的方法相比,本文的特点和优势在于:
同时考察天然配体及其镜像对映体在游离态和结合态下的立体化学差异,全面揭示手性效应。 将NMR、ITC、smFRET等多种实验技术和计算模拟方法相结合,从动力学、热力学和结构多个层面阐明分子识别机制。 覆盖了蛋白质相互作用从无序到有序的完整连续谱,揭示了手性依赖性与结构无序程度的关联。 基于核心结合区域与侧翼区域偶联折叠差异性,提出了一个统一的分子识别模型。 利用多个分析和可视化手段如SCSs、R2弛豫、CEST/ZZ交换谱等,定量和定性地表征了无序态动力学变化。
蛋白质相互作用的手性效应沿无序-有序连续体变化
本文系统考察了蛋白质相互作用无序-有序连续体的手性效应,通过应用一系列生物物理学实验方法, 获得了以下关键发现:
1. 完全无序和完全有序两个极端复合物的手性依赖性截然不同
作者选取ProTα:H1和MCL1:PUMA这两个分别代表完全无序和完全有序的蛋白质复合物体系,通过CD、NMR、ITC和smFRET实验系统比较了L和D构象肽段的结合能力。结果发现:
l-H1155–175 and d-H1155–175 produced similar CSPs in ProTα (Fig. 2c), which we quantified by calculating the difference between the CSPs induced by l- and d-enantiomers (ΔCSPl-d) at equimolar concentrations of each enantiomer of the H1155–175 peptide (Fig. 2d). We probed the affinity (Kd) and thermodynamic proper-ties using isothermal titration calorimetry (ITC), finding the same values for the enantiomers in terms of Kd (Fig. 2e and Extended Data Table 2).
即对于ProTα:H1体系,L和D构象肽段诱导的化学位移变化相似(图2c,d),且结合常数Kd也基本相同(图2e),表明该复合物可不依赖于手性结合。
>By contrast, for MCL1:PUMA, l-PUMA bound with nanomolar affinity, whereas d-PUMA appeared not to bind (Fig. 2i and Extended Data Table 2). By increasing the concentrations of both MCL1 and d-PUMA considerably, we were able to observe a Kd value in the high micromolar to low millimolar range (Fig. 2j).
相比之下,对于MCL1:PUMA体系,只有L构象PUMA能以纳摩尔亲和力结合,而D构象PUMA在高浓度下才能观察到微摩尔量级的弱结合(图2i,j),表明该复合物严格依赖手性匹配。
smFRET实验进一步证实,L和D构象H1155-175与ProTα结合诱导的构象变化相似(图2f),而MCL1与L构象PUMA结合诱导明显的构象选择和折叠(图2k,l)。
图2
这一发现突破了经典的分子识别模型,揭示了蛋白质相互作用手性依赖的两个极端形式,为理解分子手性识别多样性奠定了基础。
2. 中间态复合物的手性效应沿无序-有序连续体变化
为了考察介于完全无序和有序之间的复合物其手性效应,作者选取了RST结构域与3个转录因子的相互作用体系。ITC结果显示:
Comparing the effect of stereochemistry, we observed larger differences in Kd values as the interactions probably became more structured—that is, the difference between L-ANAC046 and D-ANAC046 was 15-fold (Fig. 3d), the difference between L-DREB2A and D-DREB2A was 72-fold (Fig. 3e) and the difference between L-ANAC013 and D-ANAC013 500-fold (Fig. 3f).
随着相互作用从ANAC046到DREB2A再到ANAC013变得更加structured,L和D构象肽段的结合常数Kd差异从15倍增加到72倍再到500倍(图3d-f)。
NMR实验揭示了化学位移扰动(CSP)和横向弛豫速率(R2)等动力学参数的系统变化(图3g-i):
The trend suggested that the amount of structure required for binding reduced the propen-sity of the D-enantiomer to interact with RST. This interpretation was further supported by comparing ΔCSPl-d of RST induced by ANAC046 (Fig. 3g), DREB2A (Fig. 3h) and ANAC013 (Fig. 3i). The ΔCSPl-d values of RST were substantial upon addition of ANAC013 and minimal upon addition of ANAC046. The same trend was observed in the pattern of peak intensity changes of RST (Extended Data Fig. 3), suggesting that ANAC046 is relatively disordered in complex with RST, whereas ANAC013 is more structured, and therefore less likely to interact with RST as a D-enantiomer.
L和D构象诱导的CSP差异沿ANAC046-DREB2A-ANAC013递增(图3g-i),峰强度和弛豫变化趋势与之一致(Extended Data Fig. 3),表明ANAC046与RST结合时保持相对无序,而ANAC013则形成更多结构,因此后者结合D构象肽段的倾向性更低。
图3
该发现首次在分子水平揭示了蛋白质相互作用手性依赖沿无序-有序连续体的系统变化规律,为理解生物大分子识别的结构基础提供了全新视角。
3. 复合物的手性识别依赖于核心结构域与侧翼区结构耦合
作者进一步整合NMR实验数据和Alphafold3结构预测模型,阐明了复合物结构与手性识别的关联。CEST和ZZ交换实验揭示(图4a):
A distinct pattern in structure emerges from the secondary chemical shifts (SCSs) (Fig. 4a). In their bound state, all three peptides have a similar core region comprising a short strand followed by a turn.
3个RST结合肽在复合物中均含有一个由turn连接的短β折叠构成的核心结构域。其侧翼区螺旋结构形成的差异(图4a-c)与其横向弛豫速率变化(图4c)、结合常数Kd的手性差异(图4f)以及结合焓变ΔH和熵变ΔS的变化趋势(图4e)高度耦合。
图4
这一发现揭示了无序蛋白质结合伴随的"偶联折叠"行为对手性识别至关重要,只有保守的疏水性核心区相互作用不足以区分对映异构体。侧翼区的结构形成程度决定了复合物动力学特征和结合能量学参数对分子手性的敏感性。
该发现突破了经典的"诱导契合"模型,提出了"偶联折叠"新机制,为理解和操纵生物大分子手性识别提供了新思路。
小结
综上所述,该研究系统考察了蛋白质相互作用的立体化学效应,获得了以下核心发现:
无序复合物可不依赖手性结合,而有序复合物严格依赖手性匹配; 介于二者之间的复合物,其手性依赖沿无序-有序连续体呈系统变化; 复合物的手性识别能力由保守核心结构域与侧翼区结构耦合形成决定。
这些发现从分子水平系统阐明了蛋白质相互作用的手性效应,突破了经典的分子识别模型,为理解生命过程手性选择、开发手性药物分子以及设计新型生物催化剂提供了重要启示。
影响和启示
本文的研究成果将给学术界和产业界带来重要影响:
推动蛋白质科学从经典的"结构-功能"范式向"无序-功能"范式拓展,加深对生物大分子非经典相互作用模式的认识。 为开发针对无序蛋白的D-肽类药物提供理论基础和实验依据,有望克服传统药物的局限性,发展新型治疗手段。 为合成具有非天然手性的功能性材料和器件提供新思路,拓宽人工构建分子机器的化学空间。 对于起源生命体系的手性选择和分子演化机制研究具有重要启示意义。
未来方向和机遇
未来在无序蛋白相互作用手性效应研究方向上,还有许多值得进一步探索的科学问题和技术挑战:
揭示无序蛋白质复合物的手性识别和耦合折叠机制的物理化学基础。 系统阐明无序态相互作用能量学与分子内、分子间运动的关联。 发展用于原位表征瞬态无序复合物结构动力学特征的新方法。 探索手性依赖的无序蛋白质相互作用在蛋白质液-液相分离中的作用。 通过定向进化等合成生物学手段,创制具有新颖功能的非天然手性分子机器。
Critical Thinking
所考察的蛋白质体系数量有限,覆盖的序列和结构空间不够全面,研究结论的普适性有待更多实验验证。 对无序复合物的结构表征主要基于二级结构化学位移和弛豫数据,缺乏原子分辨率的三维结构信息。Alphafold预测结构可靠性有待实验验证。 对于手性识别的热力学和动力学机制,缺乏更精细的定量分析,如构象熵、溶剂化效应等对结合能量学的贡献尚不明确。 文章虽讨论了无序复合物的生物学意义和药物设计启示,但对其生理病理功能的分子基础缺乏深入阐述。D-肽类分子在体内的稳定性、免疫原性等药学性质有待评估。 对于手性选择在蛋白质进化和起源生命过程中的作用,论文缺乏更多实验依据支撑,部分论述较为推测性。
Biosyn导师：Birthe B. Kragelund
https://www1.bio.ku.dk/english/research/bms/sbinlab/bbk/
Birthe B. Kragelund是丹麦哥本哈根大学生物系结构生物学与核磁共振实验室(SBiN-Lab)的四个研究小组之一的领导者。她的研究组在蛋白质相互作用、结构与功能关系方面具有丰富的专业知识,主要采用核磁共振波谱学和生物物理学方法进行研究。其特点是与生物学、医学和工业界建立了强有力的合作基础。
她的研究兴趣主要集中在以下几个方面:
通过蛋白质之间的特定原子相互作用,传递明确的信号,即时调控细胞内分子水平的产生和活动,从而揭示生命复杂性的一个方面——信号传导级联反应。 在细胞内,蛋白质与其伙伴分子之间存在多种不同类型的相互作用。理解这些相互作用的分子细节是调控蛋白质功能的关键。 通过应用核磁共振波谱、X射线晶体学、蛋白质工程和生物物理技术,她的团队试图绘制参与受体激活、细胞分裂、信号转导、免疫激活和蛋白质降解等过程的相互作用机制。 他们的研究重点包括膜结合蛋白受体、内在无序蛋白和抗菌肽。这些蛋白类别的相互作用尤为重要,因为它们或者使信号跨膜传递,或者实现从无结构蛋白传递信息,这对结构-功能范式提出了profound challenge。 所有这三类蛋白质都能识别并与大量不同大小、结构和功能机制的蛋白质相互作用。理解生物活性分子如何在不同的可能相互作用伙伴之间进行选择和区分,以及这些相互作用背后的原理,是当今蛋白质科学和分子生物学的重要问题。
