论文的研究目标及其重要性
这篇论文的研究目标是阐明一类不同于经典萜类环化酶(Terpenoid cyclases, TCs)的新型酶BcABA3的分子结构基础。BcABA3催化法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate, FPP)环化生成(2Z,4E)-α-离子基乙烷,是真菌生物合成重要植物激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)的关键酶。然而它与典型TCs序列同源性很低,缺乏经典TCs的天冬氨酸富集金属离子结合基序。因此BcABA3代表了一类新型的TCs。
These TCs were tentatively named ABA3 after BcABA3, a fungal enzyme that catalyzes the cyclization of FPP to construct the carbon skeleton of an important phytohormone abscisic acid.
揭示BcABA3这类新型TCs的结构、催化和底物结合机制,不仅可以加深对TCs结构与功能多样性的认识,也为利用BcABA3开发ABA及其衍生物的生物合成途径、调控作物生长发育奠定了分子基础。这对于农业生物技术产业的发展具有重要意义。
论文的新思路和研究方法
为获得BcABA3的结构信息,论文从以下几个方面进行了系统研究:
除了BcABA3,还克隆表达了两个其他真菌来源的同源蛋白RuABA3和SkABA3,它们的氨基末端(N-terminus)相比BcABA3更稳定,更利于结晶。同时也对N端截短的BcABA3和RuABA3进行了表达纯化和结晶。 测定了BcABA3、RuABA3和SkABA3及其复合物的多个高分辨率晶体结构,揭示了它们全α螺旋的整体折叠构象。
All structures adopt an all-α-helix fold and have a missing fragment between helix α11 and α12...
通过复合物结构,揭示BcABA3利用一个保守的谷氨酸残基Glu124与水分子络合镁离子簇,参与底物焦磷酸(PPi)基团的结合。这不同于经典TCs利用天冬氨酸富集基序与金属离子配位的模式。
Neither the Mg2+C-corresponding site nor the Mg2+C-binding NSE/DTE motif-comprising residues in the canonical TCs was found in RuABA3/ FSPP and SkABA3/PPi
鉴定一个位于α13-α14环区的锌离子结合基序,虽然该基序远离活性位点,但可能通过稳定延伸到活性位点上方的环区,维持底物结合口袋构象完整性。 基于复合物结构信息,通过定点突变实验验证了一系列参与底物结合和催化反应的关键残基。 提出了BcABA3参与的FPP环化反应机制的分步模型。
这些研究方法和分析手段相比以往研究的特点在于:
比较分析多个来源的同源酶,扩大了结构信息的代表性 获得了首个ABA3家族酶的底物类似物复合物结构 系统鉴定了一个新的锌离子结合基序 整合结构生物学和生物化学实验数据,提出了ABA3催化反应的分步模型
通过对三个ABA3同源蛋白的晶体结构解析,首次揭示了这类新型萜类环化酶的整体折叠和二聚化特征
本研究选取了三个来源于不同真菌和放线菌的ABA3酶(BcABA3、RuABA3和SkABA3),通过X射线晶体学方法系统测定了它们的apo型和复合物结构。结果表明,这些酶均呈现出独特的全α螺旋折叠拓扑,含有12-14个α螺旋,在α11和α12之间存在一个无序环区:
All structures adopt an all-α-helix fold and have a missing fragment between helix α11 and α12 (E326-V351 in apo- BcABA3, S327-N353 in apo-RuABA3) (Fig. 1b and Supplementary Fig. 4a).
更重要的是,晶体结构和分子排阻色谱(SEC)实验都表明,这些ABA3酶均以同源二聚体的形式存在(图1):
SkABA3 adopts an overall fold similar to the other two ABA3 proteins (Cα RMSD value, 0.783 and 0.914 Å), and two out of three polypeptides in an asymmetric unit also form the same homodimeric configuration (Fig. 1a and Supplementary Fig. 9). The SEC analysis also suggests the dimeric configuration of SkABA3 in solution (Supplementary Fig. 5).
这一系列晶体结构是首次在原子水平上揭示ABA3酶家族的整体结构特征,为深入理解其催化反应机制奠定了坚实基础。它突破了以往对TCs结构认知的局限,发现了一类构象截然不同的新型TCs。这些发现极大拓展了人们对TCs结构与功能多样性的认识。
鉴定到一个保守的锌离子结合基序,该基序通过稳定延伸到活性位点上方的环区,可能影响底物结合口袋的构象
令人惊讶的是,在所有ABA3结构中,作者都鉴定到一个位于α13和α14之间的长环区上的锌离子结合基序(图1c):
A metal ion coordinated in a tetrahedral geometry comprising four cysteines was identified on the extensive loop α13-α14 (Fig. 1c and Supplementary Fig. 7), which resembles the Zn2+ ion-coordination in other known structures.
原子吸收光谱实验进一步证实了这些ABA3酶确实结合了锌离子(补充表4)。尽管该基序远离活性位点,但定点突变实验表明,除C410外,该基序的半胱氨酸残基突变可导致BcABA3酶活性显著降低(补充图8):
Unexpectedly, substituting the Zn2+ ion -coordinating residues, except for C410, with Ala leads to the reduction in enzyme activity (Supplementary Fig. 8a).
圆二色光谱分析表明,这些突变体的二级结构与野生型酶相似(补充图8c),因此活性降低并非源于蛋白整体结构的变化。考虑到该基序所在的环区延伸至底物结合口袋上方(补充图8d),作者推测其可能通过影响口袋残基的构象而间接影响酶活性。这为理解锌离子结合基序对TCs催化过程的调控机制提供了新的视角。
RuABA3和SkABA3的底物类似物复合物结构揭示了ABA3酶独特的底物结合模式和镁离子依赖的催化机制
为了揭示ABA3酶与底物的相互作用模式,作者通过结晶浸泡方法获得了RuABA3与FPP类似物FSPP以及SkABA3与PPi的复合物结构(图2)。这是首次在分子水平上直接观察到ABA3酶与底物类似物的结合情况:
We solved the crystal structures of RuABA3 in complex with a FPP analog FSPP and SkABA3 in complex with PPi (Supplementary Fig. 11 and Supplementary Table 2). In both complexes, ligands were bound in a central pocket with their PPi moiety occupying the identical position (Figs. 2a and 3).
复合物结构显示,底物的焦磷酸(PPi)部分与蛋白上的极性残基相互作用,而疏水的碳氢骨架部分则嵌入由疏水性残基组成的口袋。尤其值得关注的是,在PPi结合的区域,可以明显看到1-2个由蛋白残基和水分子配位的镁离子,起到稳定和活化PPi基团的作用(图2和3):
Two metal ions adjacent to PPi in the SkABA3/PPi complex were observed (Fig. 2). Based on the octahedral six-coordinate geometry and the fact that Mg2+ ion is required for the reactivity of BcABA3, these metal ions were modeled with Mg2+ ions and denoted as Mg2+A and Mg2+B (Fig. 2a).
需要指出的是,与经典TCs不同,ABA3酶并不具有典型的天冬氨酸富集的镁离子结合基序。相反,它们主要依赖于一个保守的谷氨酸残基(如BcABA3中的Glu124)来络合镁离子:
A strictly conserved glutamate (E124, E126, and E80 in BcABA3, RuABA3, and SkABA3, respectively) and several water molecules, instead of the signature aspartic acid-rich motifs in the canonical TCs, account for the Mg2+ ion coordination (Figs. 2b, 3 and Supplementary Fig. 12).
这一结果揭示了ABA3酶独特的金属离子结合模式,为理解其催化过程提供了重要线索。同时,基于复合物结构信息,作者还提出了一个FPP在BcABA3作用下发生环化反应的分步机制模型(图4d),为后续实验验证和分子设计提供了理论基础。
气相色谱-质谱联用实验揭示SkABA3催化产生一种新颖的倍半萜产物,提示细菌ABA3酶的功能多样性
通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)对酶反应产物进行分析, 作者惊讶地发现,虽然SkABA3与另外两个ABA3同源酶有相似的整体结构,但其催化产物却明显不同:
SkABA3 appears to convert FPP to an isomer of (2Z,4E)-α-ionylideneethane as a fragment ion at m/z 204.20 can be identified but no hit can be found from searching the spectral library (Supplementary Fig. 10b). These analyses indicate that the main product of SkABA3 should be an unprecedented sesquiterpenoid compound, and the research on resolving its structure is now in progress in our laboratory.
这一发现具有重要意义,它表明来自不同物种尤其是细菌的ABA3同源酶可能具有截然不同的催化功能,在底物选择性和产物特异性上体现出多样性。这不仅拓宽了人们对ABA3酶家族功能的认知,也为今后从细菌中发掘新颖的倍半萜合成酶奠定了基础。后续研究有望阐明SkABA3催化产生新颖倍半萜化合物的分子机制,为开发新型天然产物的合成生物技术提供新的酶学资源。
基于复合物结构信息的定点突变实验验证了一系列参与底物结合和催化反应的关键残基
为了进一步验证复合物结构中观察到的酶-底物相互作用模式,作者系统开展了定点突变实验。结果发现,当与PPi相互作用并参与镁离子络合的极性残基(如Glu124、Arg202、Tyr242等)突变为丙氨酸时,BcABA3的酶活性显著降低,不能产生正常产物(2Z,4E)-α-离子基乙烷(图4):
Substituting PPi moiety- and Mg2+ ion-binding residues with Ala exhibit very low PPi release activity and generate no product (Fig. 4a, b).
与底物烃基部分相互作用的疏水性残基突变后也不能产生最终环化产物,但能检测到微量的可能的反应中间体β-法尼烯:
Notably, variants Y96A, I117A, F167A, L207A and F302A produce trace amount of (E)-β-farnesene, the putative reaction intermediate, and no product (Fig. 4b and Supplementary Fig. 16).
圆二色谱实验证实,这些突变体的二级结构组成与野生型酶相似(补充图15),表明活性丧失是由关键残基突变直接导致的,而非蛋白质错误折叠所致。
这些结果与复合物结构相吻合,证实了ABA3酶独特的底物结合模式和关键催化残基。它从实验水平验证了结构生物学研究的合理性,加深了人们对ABA3催化机制的理解。同时,这些突变体酶催化产生微量反应中间体的现象,也为作者提出的分步反应机制(图4d)提供了初步的实验依据。后续研究可以在此基础上,进一步优化和改造ABA3的催化性能,为开发高效的倍半萜合成酶奠定基础。
总之,本研究运用X射线晶体学、酶学实验、质谱分析等多种技术手段,系统开展了对一类新型萜类环化酶ABA3的结构与功能研究。通过对多个来源的ABA3同源酶进行比较分析,揭示了它们独特的strukturę fold,同源二聚化方式,以及由保守谷氨酸残基和水分子络合镁离子的底物结合模式,发现了一个新颖的锌离子结合基序。同時,SkABA3酶催化产生一种新颖倍半萜化合物的功能表型,为深入挖掘ABA3家族酶及其所参与的天然产物生物合成通路奠定了基础。这些结构生物学发现与酶学实验数据紧密结合,相互印证,极大地加深了人们对ABA3酶结构与功能的理解。可以预见,这些发现不仅在萜类化合物合成生物学研究领域具有重要意义,也为开发新型植物激素调节剂和药用倍半萜类天然产物提供了新的分子工具和药物先导化合物。
研究成果的影响和应用前景
本论文通过系统的结构生物学和生物化学研究,首次揭示了一类新型TCs的三维结构、催化机制和分子进化特征。这不仅极大地拓展了人们对TCs结构与功能多样性的认知,也为开发基于ABA3的倍半萜类化合物合成生物技术奠定了坚实基础。可以预见的应用方向包括但不限于:
利用BcABA3等真菌ABA3酶设计ABA及其类似物的生物合成途径,为调控作物生长发育、提高农作物产量和抗逆性提供新的工具和策略。 基于SkABA3催化产生新颖倍半萜骨架的发现,進一步挖掘细菌ABA3的结构和功能多样性,发现更多结构新颖、具有重要生理活性的倍半萜类天然产物及其生物合成机制。这些天然产物不仅可能具有重要的农用价值,也可能在医药领域有重要应用前景。 在已知TCs骨架上引入ABA3特有的结构基序如锌离子结合基序,可能发掘出催化机制新颖的TCs,用于多样化萜类化合物的合成生物技术开发。
综上所述,该论文对于TCs酶家族的基础研究和应用开发均具有重要意义,为开发新型萜类化合物的生物合成技术、创制调控植物生长的农用制剂、发现结构新颖的药用倍半萜类天然产物提供了新的思路和工具。研究人员可以关注以下几个方面:
利用ABA3酶的结构信息,通过定向进化等手段改造其底物和产物特异性,用于合成结构多样的倍半萜类化合物 在不同物种尤其是细菌中发掘序列和结构新颖的ABA3同源酶,挖掘其催化潜力和代谢多样性 整合代谢工程策略,利用ABA3酶设计ABA及其结构类似物的微生物细胞工厂,满足农业生产中对新型植物生长调节剂的需求
进一步探索的问题和挑战
尽管本研究取得了一系列重要发现,但仍有一些问题和挑战值得进一步探索:
BcABA3催化反应的分步机制有待实验证实。作者提出的反应模型有一些关键步骤尚缺乏直接实验支持,如Tyr313、Arg202和Arg312作为质子转移的关键残基,β-法尼烯和allofarnesene作为反应中间体等。需要运用同位素示踪、中间体捕获、时间分辨光谱等实验手段进一步验证。此外尚不清楚C10质子化的质子是如何提供的。 BcABA3催化过程中构象变化的动态机制有待深入研究。已有的晶体结构提供了不同状态下的ABA3"快照",但如何在反应进行时动态耦合构象变化以驱动反应步骤的进行,尚需更多的生物物理研究如分子动力学模拟等。 其他ABA3酶特别是细菌ABA3酶的结构与功能多样性有待进一步挖掘。SkABA3结构表明其可能催化产生不同于(2Z,4E)-α-离子基乙烷的新颖产物,这提示细菌ABA3可能是发现新型倍半萜天然产物的重要资源,需要系统开展生物信息学挖掘和实验验证。 ABA3酶催化机制的精准调控策略有待开发。如何通过定向进化和理性设计相结合的方式,对ABA3的底物特异性和催化效率进行精准改造,从而实现特定倍半萜类化合物的高效定向合成,还需更多的研究积累。
上述科学问题的解决,可能会催生出一些新的关键技术和机会:
微生物细胞工厂生产ABA及其类似物,替代传统的化学合成 基于结构生物学的ABA3酶定向进化技术,用于开发高效的倍半萜合成酶 新型植物生长调节剂的开发及其在农业中的应用 结构新颖、具有重要生理活性的倍半萜类天然产物的发现及其在医药中的应用
