论文的研究目标和意义
这篇发表在Science杂志上的论文旨在揭示茄科植物中一类重要的次生代谢物--甾体皂苷和甾体糖生物碱的生物合成机制。这两类化合物不仅具有广泛的药用价值,还在植物抗虫方面发挥重要作用。然而,它们的合成通路尚未被完全阐明。
Solanaceae plants have evolved to synthesize cholesterol, which is converted into a wide variety of specialized metabolites
论文选取了龙葵(Solanum nigrum)作为研究对象。龙葵能够在叶片中合成甾体皂苷uttroside B,在果实中合成多种甾体糖生物碱,它们共享相同的胆固醇前体。
Black nightshade (Solanum nigrum), a medicinal plant belonging to the Solanaceae family, produces two classes of specialized metabolites from this common cholesterol precursor: steroidal saponins in leaves, and steroidal glycoalkaloids in berries.
了解甾体化合物的生物合成机制,对于利用代谢工程技术高效合成这些高附加值化合物,发展基于次生代谢物的植物抗虫技术都具有重要意义。
The discovery of GAME15 provides an opportunity for metabolic engineering for production of industrially important SGAs and saponins, allows the possibility of exploring steroidal saponins as a new target for plant defense.
论文的创新性思路和方法
论文通过对龙葵进行转录组测序和共表达分析,发现了一个与甾体皂苷和糖生物碱代谢相关的关键基因--GAME15。它编码一个纤维素合酶样蛋白,属于Csl-M亚家族。
Co-expression analysis of the S. nigrum transcriptome revealed 363 genes that were co-expressed with all three GAMEs [GAME6, GAMES and GAME11; correlation coefficient (r) ≥ 0.84]. One of these genes annotated as cellulose synthase like protein (classG) exhibited strong co-expression with these baits.
研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除了龙葵中的GAME15基因,发现突变体完全丧失了合成甾体类化合物的能力,而胆固醇前体大量积累。这表明GAME15参与调控甾体类次生代谢物的生物合成。
Editing of game15 (game15ko) had no apparent effect on growth and development of the mutant lines as evidenced by visual inspection. However, metabolite profile analysis by liquid chromatography-triple-quadrupole mass spectrometry (LC-QqQMS) showed that uttroside B, the major steroidal saponin in the leaves of wild type (WT) plants, was lost in game15ko edited plants.
进一步的亚细胞定位和蛋白质相互作用分析发现,GAME15定位于内质网膜上,能够与甾体生物合成途径的早期酶如GAME6、GAME8、GAME11发生互作,暗示其可能作为一个支架蛋白发挥作用。
GAME15 was localized to the membrane of the endoplasmic reticulum. Split luciferase and pull down assays revealed that GAME15 interacts individually with GAME6, GAME8 and GAME11 proteins. Although these experiments strongly suggest that GAME15 acts as a structural protein in these pathways, we cannot definitively rule out the possibility that GAME15 has any catalytic activity.
研究者进一步在烟草中异源表达了GAME15和上述关键酶基因,成功重构了呋甾醇中间体及下游甾体皂苷、糖生物碱的生物合成。
论文巧妙地利用多组学联合分析、基因编辑、蛋白质互作和异源表达等多种手段,系统揭示了一个新的支架蛋白在调控植物特化代谢方面的核心作用,很好地展现了现代合成生物学研究策略的优势。
GAME15基因编码一个支架蛋白调控甾体类次生代谢物的生物合成
1. GAME15的功能缺失导致龙葵完全丧失合成甾体皂苷和糖生物碱的能力
作者利用CRISPR/Cas9技术敲除了龙葵中纤维素合酶样蛋白基因GAME15,通过比较野生型和突变体植株的代谢产物,发现GAME15参与调控甾体类次生代谢物的生物合成。
Metabolite profile analysis by liquid chromatography-triple-quadrupole mass spectrometry (LC-QqQ-MS) showed that uttroside B, the major steroidal saponin in the leaves of wild type (WT) plants, was lost in game15ko edited plants (Fig. 2B). The SGAs α-solasonine, α-solamargine and malonyl-solamargine found in green unripe berries of wild type plants were lacking in the unripe berries of edited plants (Fig. 2C).
突变体植株叶片和浆果中分别缺失甾体皂苷uttroside B和多种甾体糖生物碱,而其共同的前体化合物胆固醇则大量积累(Fig. 2D,E)。这些结果表明,GAME15编码一个关键的调控因子,其功能缺失导致下游甾体代谢途径被阻断。
图2
研究突破了以下认知瓶颈:
传统观点认为,植物次生代谢通路主要由一系列催化酶构成,很少关注非酶类调控因子。本研究首次在茄科植物中鉴定出一个支架蛋白,证实了其在甾体代谢调控中的关键作用。
过去对龙葵等非模式植物中甾体化合物的生物合成机制所知甚少。通过开展龙葵的功能基因组学研究,本文填补了这一知识空白。
2. GAME15定位于内质网膜,并与甾体生物合成途径的早期酶发生互作
为阐明GAME15调控甾体生物合成的分子机制,作者系统开展了亚细胞定位和蛋白质互作分析。共聚焦显微镜观察显示,GAME15-GFP融合蛋白与内质网标记物mCHERRY-HDEL共定位(Fig. 2F),表明GAME15是一个内质网膜蛋白。
进一步的pull-down实验证实,GAME15能够与甾体生物合成途径早期的一系列酶如GAME6、GAME8、GAME11发生特异互作(Fig. 3C-F)。这些酶催化胆固醇羟化、内酯化等反应,生成呋甾醇中间体。
图3
基于以上结果,作者提出GAME15可能作为一个"支架蛋白",通过在内质网膜上募集和组织关键酶,促进代谢通量朝向甾体皂苷、糖生物碱的方向流动。这一设想颠覆了经典的酶促反应动力学模型,为深入理解复杂天然产物的生物合成机制提供了新视角。
The presence of GAME15 on the ER membrane could be necessary for the channeling of cholesterol from the ER lumen where it is synthesized, to the ER membrane where the first three hydroxylation steps catalyzed by the GAME6, GAME8 and GAME11 take place, while preventing diffusion of the toxic intermediate.
3. 在烟草中异源共表达GAME15及相关酶成功实现甾体皂苷、糖生物碱的原位生物合成
为进一步证实GAME15及其互作蛋白在甾体类次生代谢物合成中的功能,研究者构建了多元基因表达载体,在烟草叶片中异源表达GAME15及生物合成途径的关键酶基因。
当GAME15与GAME6、GAME8、GAME11共表达时,可检测到皂苷元aglycon、diosgenin的生成(Fig. 4)。当GAME4、GAME12也加入共表达体系后,可进一步检测到糖生物碱元 aglycon、solanidine的产生。值得注意的是,不表达GAME15时,仅表达其互作酶并不能检测到上述中间产物。
图4
这一结果有力支持了GAME15在调控甾体类次生代谢物生物合成中的关键作用,同时也为异源合成这类重要天然产物提供了新策略。这是首次在非茄科植物中成功重构甾体皂苷、糖生物碱的生物合成,突破了以下技术障碍:
过去由于缺乏对完整合成途径的理解,在异源宿主中很难实现这些复杂分子的从头合成。本研究采用组合生物合成策略,引入关键酶和支架蛋白,成功实现了从胆固醇到甾体糖苷、生物碱的多步骤转化。
与大肠杆菌、酵母等微生物相比,植物细胞能够提供更加天然的亚细胞环境,更有利于膜蛋白的表达和装配。本研究开创性地在烟草中构建了一个高效的"植物细胞工厂",为今后开发甾体类药物先导化合物提供了新平台。
4. GAME15功能缺失破坏龙葵对重要农业害虫的抗性
除了调控甾体皂苷、糖生物碱的生物合成外,作者还探索了GAME15介导的次生代谢在生态中的功能。他们意外地发现,game15突变体对温室中自然存在的昆虫更加敏感,植株受害更严重(Fig. 5A)。
在体外的选择性取食实验中,game15突变体明显更容易被龙葵体内的优势害虫之一Empoasca decipiens 取食(Fig. 5C,D)。此外,突变体对农业"超级害虫"马铃薯甲虫的抗性也显著降低(Fig. 5F,G)。野生型龙葵叶片含有大量甾体皂苷,而突变体叶片中几乎检测不到皂苷(Fig. 5B),暗示甾体皂苷可能在植物抗虫中发挥重要作用。
Steroidal saponin-deficient S. nigrum plants were remarkably susceptible to a natural herbivore of nightshade, leafhopper Empoasca decipiens, as well as the agricultural "super-pest," Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say).
图5
这一发现具有重要意义:
过去对甾体皂苷等植物次生代谢物在生态中的功能知之甚少。本研究首次系统评估了内源性甾体皂苷对植物抗虫性的贡献,揭示了一种新的植物防御机制。
传统农药的过度使用带来了环境污染和害虫抗性等问题。本研究利用基因编辑手段调控植物自身的防御代谢,为开发新型植物源杀虫剂、培育抗虫作物新品种提供了新思路。
核心发现总结
综上所述,本研究在茄科植物龙葵中鉴定出一个新的甾体代谢调控因子GAME15,证实其作为支架蛋白通过在内质网募集关键酶促进甾体皂苷、糖生物碱的生物合成。GAME15基因的敲除导致龙葵完全丧失这些防御性代谢物,植株对农业害虫的抗性显著下降。研究者进一步利用GAME15,在烟草中成功实现了甾体类天然产物的异源合成。总体而言,GAME15的发现不仅加深了人们对植物特化代谢调控机制和生态功能的理解,也为开发高值甾体类药用分子、创制植物抗虫新策略提供了新思路(Fig. 1)。
图1
研究成果的应用前景
GAME15的发现对于通过代谢工程途径生产甾体皂苷、糖生物碱等高附加值化合物具有重要启示。
传统上,人们多关注生物合成途径中起催化作用的酶,而忽视了调控因子的作用。本研究表明,引入合适的支架蛋白,有利于提高关键酶的催化效率和代谢流通量,在植物细胞中实现目标化合物的高效合成。
同时,研究还发现GAME15突变体对金花虫、马铃薯甲虫等重要害虫极为敏感,揭示了甾体皂苷在植物抗虫防御中的新功能。这为开发新型植物源杀虫剂、培育抗虫作物新品种提供了新的靶标和思路。研究者可进一步探索GAME15等关键基因的等位变异及其与植物抗虫性状的关系,通过分子设计育种的手段培育高抗虫、低糖生物碱的茄科作物品种。
While loss of GAME15 did not visibly affect the phenotype of the mutant lines, we noticed that these plants were more susceptible to pest insects compared to the wild type S. nigrum plants.
未来研究方向和机遇
本研究在支架蛋白调控植物特化代谢方面取得突破,同时也为相关领域的进一步研究指明了方向:
深入解析GAME15与下游糖基转移酶等其他蛋白的互作网络,阐明其对代谢物糖基化修饰的调控机制。这有助于创制和定向合成结构多样的皂苷、生物碱衍生物。
利用蛋白质组学、代谢组学等手段,在更多物种中鉴定类似GAME15的新型支架蛋白及其互作酶,揭示调控植物次生代谢的普遍规律。
探索将GAME15及其互作酶导入酵母等异源宿主,建立微生物细胞工厂,实现甾体类药用分子的工业化生产。这可能吸引合成生物学、制药领域的投资。
开发基于GAME15等调控因子的新型植物抗虫技术,如通过基因编辑、合成生物学手段,在作物中构建"甾体皂苷代谢模块",实现植物自身抗虫能力的提升。
Critical Thinking
GAME15是否具有糖基转移酶活性尚未明确。尽管互作组学和异源表达实验支持其作为结构蛋白的功能,但并不能完全排除其可能的催化活性。这需要通过蛋白质结构解析、体外酶活检测等实验加以证实。
Although these experiments strongly suggest that GAME15 acts as a structural protein in these pathways, we cannot definitively rule out the possibility that GAME15 has any catalytic activity.
目前对GAME15调控甾体代谢的分子机制仍不清楚。它是通过增强互作酶与底物、辅因子的结合,还是通过影响酶的空间构象,或是通过募集其他调控因子发挥作用,有待深入研究。
GAME15突变体叶片中完全缺失甾体皂苷,这一表型能否在其他茄科植物如马铃薯、番茄中重现,抗虫效果如何,需要更多实验数据支持。
论文主要关注game15突变对甾体代谢和植物抗性的影响,但对突变体其他表型的描述不够详细。GAME15是否也参与初生代谢、植物生长发育的调控,值得系统评估。
