研究目标与意义
本文于2024年11月4日在线发表于Nature Plants。旨在通过解析拟南芥ABC转运蛋白G16(AtABCG16)在不同状态下的高分辨率三维结构,阐明其特异性识别与跨膜转运植物激素**茉莉酸(jasmonic acid, JA)**的分子机制。茉莉酸是一类调控植物生长发育以及抗逆反应的关键信号分子。虽然前人已鉴定出多种参与茉莉酸亚细胞转运的转运蛋白,但对其精细结构与分子机制的认识仍十分有限。
Jasmonates (JAs) are a class of oxylipin phytohormones including jasmonic acid (JA) and derivatives that regulate plant growth, development and biotic and abiotic stress. A number of transporters have been identified to be responsible for the cellular and subcellular translocation of JAs. However, the mechanistic understanding of how these transporters specifically recognize and transport JAs is scarce.
深入理解转运蛋白AtABCG16的分子机制,将有助于阐明植物激素转运的普遍规律,并为设计与调控植物生长发育和抗逆性状的农业生物技术提供理论基础。此外,转运蛋白结构生物学研究也有望为开发新型药物提供重要的分子靶标。
研究思路与方法创新
为获得AtABCG16转运茉莉酸过程中不同时间点的高分辨率三维结构,本文创新性地采用了冷冻电镜技术。通过在不同状态下(即未结合ATP和底物、已结合底物、已结合ATP类似物)对AtABCG16进行成像,本文分别解析出了4种构象状态下的结构:
无底物结合的向内开放构象(inward-facing apo conformation)
结合茉莉酸底物的向内开放构象(JA-bound inward-facing conformation)
推测的茉莉酸跨膜转运后的向外开放构象(outward-facing post translocation conformation)
茉莉酸跨膜转运中的闭合构象(inward-facing occluded conformation)
we determined the cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structure of JA exporter AtABCG16 in inward-facing apo, JA-bound and occluded conformations, and outward-facing post translocation conformation.
这些精细的结构信息,为全面理解AtABCG16的工作机制奠定了关键基础。在此之前,虽然人们对AtABCG16参与茉莉酸转运有一定的功能研究,但缺乏足够高分辨率的结构信息来阐明其分子机制。本研究利用cryo-EM技术所获得的原子级分辨率结构,使我们能够在原子-分子水平上洞察其工作机理,推动了本领域的研究。这也展示了cryo-EM技术在膜蛋白结构生物学研究中的强大应用潜力。
一、AtABCG16的整体结构与功能特征
通过cryo-EM技术,作者解析了AtABCG16在四种不同构象状态下的高分辨率三维结构(分辨率2.38-2.95Å),包括:无底物结合的向内开放构象(inward-facing apo)、结合茉莉酸底物的向内开放构象(JA-bound inward-facing)、推测的茉莉酸跨膜转运后的向外开放构象(outward-facing post translocation)和茉莉酸跨膜转运中的闭合构象(inward-facing occluded):
we determined the cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structure of JA exporter AtABCG16 in inward-facing apo, JA-bound and occluded conformations, and outward-facing post translocation conformation.
这些结构表明,AtABCG16是一个同源二聚体,每个亚基包含一个核苷酸结合结构域(nucleotide-binding domain, NBD)、一个跨膜结构域(transmembrane domain, TMD)和一个胞外结构域(extracellular domain, ECD)(图1b,d)。NBD参与ATP的结合与水解,TMD的六个跨膜螺旋(TM1-TM6)形成底物转运通道,ECD可能在底物转运和蛋白功能调控中起重要作用。
图1
这是首次在近原子分辨率水平上解析AtABCG16的精细结构,为深入理解其分子机制奠定了坚实基础。过去虽有AtABCG16参与茉莉酸转运的功能研究,但缺乏结构方面的直接证据。本研究利用cryo-EM技术所获得的多种构象结构弥补了这一空白,为阐明其工作机理提供了关键线索。
二、茉莉酸识别的关键结构基础
在AtABCG16的向内开放构象中,作者鉴定到两个对称的、半跨膜的底物结合口袋(substrate-binding pocket),每个口袋可结合一个茉莉酸分子(图2):
In the structure of AtABCG16inward-JA , two slit-like hydrophobic substrate-binding pockets are defined halfway across the membrane and only accessible from the inner leaflet of the lipid bilayer (Fig. 2a,b and Extended Data Fig. 7a,b). The pockets are formed by TM1, TM2 and TM5a from both monomers (Fig. 2c), reaching a volume of 880 Å3 calculated by ProteinPlus.
结合位点主要由TM1、TM2和TM5a上的疏水性残基组成,可与茉莉酸的羧基和环戊烷环形成氢键和范德华相互作用(图2d)。突变实验证实,Thr460、Tyr494和Tyr601等关键残基的突变会显著削弱AtABCG16的茉莉酸转运活性和生理功能(图2f-h):
In Xenopus oocytes, Y494A mutation could impair the transport activity of AtABCG16, while T460A mutation has minor effects on the transport activity of AtABCG16 (Fig. 2f). In Arabidopsis, exogenous JA application could inhibit the primary root length of Col-0 plants, and knockout of atabcg16 could counteract the function of JA, which is consistent with the literature. Meanwhile, we found that complement atabcg16 with wild-type AtABCG16 could restore the short root-length phenotype when JA was applied, while complement with AtABCG16 containing T460A, Y494A or Y601A mutation could not restore the JA-induced short root-length phenotype (Fig. 2g,h).
图2
这些结果揭示了AtABCG16特异性识别茉莉酸底物的关键结构基础,突破了过去对其底物结合机制缺乏原子级分辨率认识的瓶颈。作者巧妙地将结构生物学与生化和植物生理学实验相结合,从多个层面阐明了底物识别的分子机制,极大地深化了我们的认知。
三、ATP水解驱动的跨膜转运机制
通过在不同ATP类似物存在下解析AtABCG16的结构,作者揭示了ATP结合与水解引起核苷酸结合结构域(NBD)和跨膜结构域(TMD)构象的动态变化,由此阐明了茉莉酸跨膜转运的分子机制:
无底物结合时,AtABCG16处于向内开放构象,两个NBD分离,底物结合口袋通过侧向入口与细胞质相连(图3a,f)。当ATP与NBD结合后(用ADP-BeF3-模拟),NBD闭合,引起TMD构象变化,最终转变为向外开放构象(图3a,b,d,g)。此时底物入口关闭,结合口袋塌陷,茉莉酸被推向胞外腔。ATP水解后(用ADP-VO4模拟),蛋白质又恢复到向内闭合构象(图3a,e,h),使得整个催化循环得以重新开始。
In the ATPase cycle, ATP binding and hydrolysis induce closure and separation of two NBDs, which drives conformational changes in the TMDs, resulting in alternating access of substrate from the intracellular side and the extracellular side. The two CpHs transmit conformational changes at the NBD–TMD interface, and the distance between the two CpHs can reflect the separation and closure of NBDs.
图3
文章通过捕获AtABCG16在催化循环不同阶段的"静态"结构,成功地刻画了其构象状态的动态变化,形象地再现了茉莉酸跨膜转运的分子图景。这一系列结构犹如一部"分子电影",直观展现了ABC转运蛋白耦合ATP水解能量将底物跨膜转运的工作机制,突破了过去对其分子机制的认知瓶颈。
四、一种新颖的"双通道、双底物结合口袋"跨膜转运模型
与经典的ABC转运蛋白"单通道"底物转运模型不同,作者提出AtABCG16采用了一种新颖的"双通道、双底物结合口袋(bifurcated translocation pathway)"机制(图4):
JA translocates through AtABCG16 via a featured bifurcated pathway, which is composed of two independent substrate entrances, two substrate-binding pockets and a shared apoplastic cavity. The substrate entrances are defined at the inner leaflet of the lipid bilayer and connect to their independent substrate-binding pocket, while the cytosolic side is blocked by TM5a/TM5a′ which separated the substrate-translocation pathway into a bifurcated one (Figs. 3f and 4a).
在该模型中,跨膜结构域的两个半通道分别连接两个独立的底物结合口袋,但共享同一个胞外腔。这种双通道布局有利于AtABCG16高效转运茉莉酸底物。此外,位于跨膜通道中段的Phe608残基可能扮演"门控"角色(图4),调控茉莉酸在细胞质和胞外间的转运:
Featured by this inward-facing occluded conformation, the π-stacking interactions between the tyrosine residues (Tyr494/Tyr494′ and Tyr592/Tyr592′) in the outward-facing conformation are breaking to re-open the substrate entrance (Fig. 3h). Furthermore, the conformational change also occurs near the TMD–ECD interface when the substrate exit is extending. ... residues Phe608 from each monomer undergo a downward flip, which may function as a middle-TM gate controlling the closing and opening of the translocation pathway.
图4
"双通道、双底物结合口袋"模型的提出,颠覆了传统的ABC转运蛋白"单通道"工作模式,极大拓展了我们对ABC转运蛋白超家族功能多样性的认知。尽管目前还缺乏更多实验证据支持该模型,但其新颖的设计思路无疑为将来的研究指明了方向。
五、AtABCG16介导茉莉酸跨膜转运的分子电影
综合多种构象状态的结构信息,作者提出了一个AtABCG16介导茉莉酸跨膜转运的分子机制模型(图5):
无底物结合时,AtABCG16处于向内开放构象,两个NBD分离,TMD形成通往胞质的底物入口(图5a,d)。当茉莉酸与结合口袋中的关键残基Thr460和Tyr601发生相互作用后(图5a),ATP结合引发TMD构象变化,底物入口关闭,底物结合口袋塌陷,AtABCG16转变为向外开放状态,茉莉酸被推向胞外腔而释放(图5b)。ATP水解驱动NBD解离,TMD又恢复到向内闭合构象,完成一个催化循环(图5c,d)。
In the resting state, AtABCG16 adopts an inward-facing conformation with the substrate entrance open to the cytoplasm. The key residues at the entrance (Thr460 and Tyr601) and tyrosine residue (Tyr494) in the substrate-binding pocket could recognize and receive JA when it occurs, as evidenced by the JA-bound AtABCG16inward-JA structure (Fig. 5a). ATP binding to the NBDs drives the process of JA translocation, leading to overall conformational change from inward-facing to outward-facing states, as evidenced by the BeF 3 − trapped AtABCG16outward-open structure (Fig. 5b). This change involves closing of the substrate entrances and exposing of the apoplastic cavity in TMDs, and JA release through the translocation pathway towards the exit located at the TMD–ECD interface. After ATP hydrolysis, the transporter reverts to inward-facing state with both ends of the translocation pathway closed, leading to an inaccessible substrate-binding pocket, as evidenced by the VO4 -trapped AtABCG16occluded structure (Fig. 5c). The release of ADP moiety will reset the transport cycle to the resting or apo state, represented by the AtABCG16apo structure (Fig. 5d).
图5
该模型生动再现了茉莉酸转运的完整过程,犹如一部精彩的"分子电影",将AtABCG16复杂的构象变化和催化循环机制可视化。尽管目前对该模型的一些细节还有待进一步验证,但其对解析ABC转运蛋白分子机制具有重要启示意义。
小结
本文运用cryo-EM技术,系统解析了拟南芥ABC转运蛋白AtABCG16在多个关键状态下的高分辨率结构,并结合生化和遗传学实验,从底物识别、构象耦联、跨膜转运等多个角度阐明了其介导植物激素茉莉酸跨膜转运的分子机制,极大地深化和拓展了我们对ABC转运蛋白家族结构与功能的认知。此外,作者提出的"双通道、双底物结合口袋"跨膜转运新模型也为今后的研究指明了方向。这些发现无疑是ABC转运蛋白和植物激素信号转导领域的重要进展。
研究意义与潜在应用
本研究通过系统的结构与功能分析揭示了一个完整的ABC转运蛋白介导茉莉酸跨膜转运的分子图景,不仅大大深化了我们对植物激素转运机制的理解,而且为将来针对性地调控植物的生长发育及抗逆性提供了重要的候选靶标。鉴于植物激素信号调控的复杂性,进一步开发出特异、高效、可控的植物激素转运调控技术,有望在确保粮食安全、应对极端气候等方面发挥重要作用。
同时,茉莉酸合成代谢途径的中间产物和衍生物在医药、香料等领域也有广泛应用。因此,阐明茉莉酸转运机制不仅对于植物生理学研究,而且对于开发相关化合物的生物合成技术也有重要意义,这无疑将催生出巨大的产业化应用前景。作为植物学和结构生物学领域的科研工作者,我们应该密切关注相关转运蛋白结构功能的研究进展,并积极探索结构生物学新技术新方法在膜蛋白研究中的应用潜力,力争在合成生物学、分子农业等领域做出突破性贡献。
未来研究方向与展望
通过本研究,我们对茉莉酸转运蛋白AtABCG16的分子机制有了前所未有的深刻认识。但与此同时也应看到,距离全面理解植物激素信号转导的精细调控还有很长的路要走。未来在该研究方向上还有一些问题值得进一步探索:
除了本文所涉及的AtABCG16和AtABCG25外,其他转运蛋白在茉莉酸跨膜转运中扮演什么角色?它们在不同组织器官、不同发育阶段是如何协同工作的?这可能催生出茉莉酸转运网络的系统生物学研究。
茉莉酸信号通路是如何与其他植物激素(如生长素、脱落酸等)信号通路协同互作,共同调控植物生长发育和抗逆反应的?这涉及到更为宏观、更加复杂的信号网络研究。
将茉莉酸代谢工程与合成生物学和代谢工程相结合,能否实现茉莉酸及其衍生物的定向合成和产业化制备?这对于开发新型植物生长调节剂和药用化合物具有重要意义。
植物ABC转运蛋白家族成员众多,它们在底物特异性、亚细胞定位、表达调控方面是否存在普遍规律?这可能促进转运蛋白分子机制的比较研究。
Critical Thinking
虽然作者解析了AtABCG16的多种构象状态,但对茉莉酸识别和转运的动态变化过程仍缺乏直接的实验证据。未来或许可以尝试将cryo-EM与分子动力学模拟等计算生物学方法相结合,模拟蛋白-底物作用的动态变化。
作者通过定点突变初步揭示了茉莉酸结合口袋的关键位点,但对底物特异性识别的分子机制尚缺乏更细致的表征。进一步开展结合自由能计算、分子对接等研究或许有助于阐明AtABCG16与不同茉莉酸类底物作用的差异机制。
文中主要围绕AtABCG16开展研究,对其与其他茉莉酸转运蛋白(如AtABCG25)在功能上的异同缺乏足够的讨论。进一步从进化和结构生物学角度对比分析不同转运蛋白的异同,将有助于总结ABC转运蛋白家族的结构功能规律。
作者提出的"双通道、双底物结合口袋"的分子转运模型虽然很有新意,但尚缺乏直接证据。开展转运动力学实验将有助于佐证该模型的合理性。
Biosyn导师：张鹏 https://cemps.cas.cn/sourcedb/zw/zjrc/jcqn/201812/t20181219_5218232.html
张鹏
个人简介
1998.9-2002.7 本科 山东大学生物化学与分子生物学系
2002.9-2008.1 博士 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所
2008.2-2010.10 博士后 美国普林斯顿大学分子生物学系
2010.10-2020.4 研究员 中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所
2020.5-至今 研究员 中科院分子植物科学卓越创新中心
曾入选国家基金委“优青”、“杰青”、上海市“浦江人才”、“优秀学术带头人”，中科院上海生科院“S类”人才、英国皇家学会“牛顿高级人才”等。承担科技部、基金委、中科院、上海市及英国皇家学会多项科研项目，科技部青年973项目首席科学家。担任中国生物物理学会理事，上海市生物物理学会副理事长。
研究工作
研究组利用结构生物学、生物化学及遗传学方法，研究植物重要生理过程跨膜转运与信号传递的分子机理；揭示植物体生命活动的基本规律，为作物分子设计育种提供分子基础。研究工作以通讯作者发表在Nature、Nat Struct Mol Biol、Nature Plants、Cell Res、PNAS、Nat Commun、EMBO Rep、Mol Plant等期刊上。
1)植物跨膜转运的分子机理：跨细胞膜的物质转运是细胞与内外环境之间进行物质交流的主要方式，与生命体的生长发育和环境响应等密切相关。探究植物光合产物及营养物质跨膜转运蛋白的结构与机理是我们的研究兴趣之一。
2）植物跨膜信号传递机理：跨细胞膜的信号传递是细胞与内外环境间进行信息交流的主要方式。探究植物跨膜感受环境信号的蛋白复合体的结构与信号传递机理是我们的另一研究兴趣。
3）植物重要活性小分子的合成机理解析与分子设计：研究植物体产生的活性代谢物的合成过程与机理，基于蛋白结构与机理开展分子设计。
