研究目标与意义
这项研究在2024年9月6日在线发表于Science。主要目标是利用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)技术,在接近生理条件下研究整个 Polytomella 细胞内线粒体ATP合酶的原位结构和旋转状态。ATP合酶在细胞的能量转换过程中扮演关键角色,它利用**质子动力势(pmf)**驱动 ADP 和无机磷酸生成 ATP。
Cells depend on a continuous supply of adenosine triphosphate (ATP), the universal energy currency. In mitochondria, ATP is produced by a series of redox reactions, whereby an electrochemical gradient is established across the inner mitochondrial membrane. The ATP synthase harnesses the energy of the gradient to generate ATP from adenosine diphosphate (ADP) and inorganic phosphate.
理解ATP合酶的分子机制对解释细胞如何获得能量,以及相关疾病的发生机理都具有重要意义。这项工作是在原位条件下研究膜蛋白复合物的关键一步,对于研究其他重要的膜蛋白复合物和细胞器具有重要的示范意义。从应用角度看,ATP合酶与抗生素、除草剂和抗癌药物等的研发密切相关。
研究思路与方法创新
传统的**单颗粒冷冻电镜(cryo-EM)技术需要将ATP合酶从细胞中分离提纯,利用去垢剂溶解,再进行成像和结构解析。这会破坏蛋白的天然状态,且无法研究其动态变化。该项研究利用cryo-ET和聚焦离子束铣削(FIB-milling)**等前沿技术,对完整的 Polytomella 细胞进行原位成像和分析,在保持细胞和线粒体完整性的前提下获得了高分辨率的ATP合酶结构。
We applied cryo-ET and subtomogram averaging (StA) on focused ion beam–milled (FIB-milled) Polytomella cells to image the mitochondrial ATP synthase in situ.
研究还使用了亚断层平均(StA)技术,在 4.2 埃的高分辨率下揭示了ATP合酶的不同构象状态。通过将所有的ATP合酶二聚体结构归一化叠加到同一个位置,可以区分出6个主要的旋转状态和21个更精细划分的亚状态,反映了ATP合酶工作时的旋转催化机制。
To identify distinct catalytically relevant states, we applied symmetry expansion to the subtomogram average of the dimer, followed by focused classification, masking the central stalk of the monomer without imposing C2 symmetry (materials and methods and fig. S5). In this way, we were able to distinguish six principal rotary states, which were further refined to resolve distinct features.
与之前的方法相比,这项研究在生理条件下系统研究了ATP合酶的动态变化,保留了其与膜环境的相互作用,弥补了体外研究的不足。同时该方法分辨率高、可操作性强、实验体系完整,为原位结构生物学研究树立了新的标杆。
线粒体ATP合酶原位结构与旋转催化状态研究取得新进展
本文利用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)和亚断层平均(StA)等前沿技术,在接近生理条件下系统研究了 Polytomella 细胞内线粒体ATP合酶的高分辨率结构和动态变化,取得了一系列重要发现。下面我将逐一介绍这些关键结果。
一、揭示了 ATP 合酶二聚体在线粒体内膜上的排列方式
通过对 cryo-ET 数据进行 StA 分析,研究者以 4.2 埃的近原子分辨率解析了 ATP 合酶二聚体的整体结构(图1)。在此基础上,他们发现 ATP 合酶二聚体在线粒体嵴上形成规则的长条状排列,并进一步组装成左手螺旋状的多排结构(图1B, C)。这种特殊的空间组织方式可能有利于局部质子浓度梯度的维持。
ATP synthase dimers of the flagellated microorganisms Polytomella sp. and its relative, Chlamydomonas reinhardtii, are particularly rigid because of their characteristic, bulky peripheral stalk composed of 10 ATP synthase–associated (ASA) subunits (16, 22). In the IMM, the dimers assemble into long rows (23), creating the mitochondrial cristae, which are thought to work as local proton reservoirs (19, 26, 27).
图1. 线粒体ATP合酶的原位结构
这一发现首次在原位条件下观察到了 ATP 合酶的精细排布,突破了传统负染电镜的分辨率限制,揭示了其与线粒体嵴形成的内在联系。
二、建立了ATP合酶-ASA复合物的原位高分辨率结构模型
研究者在 StA 密度图的基础上,利用灵活的分子对接和同源建模等方法,构建了包含 ASA1-10 等亚基在内的 ATP 合酶-ASA 复合物近乎完整的原子模型(图2,3)。该模型的精度明显高于此前的 cryo-EM 结构,并新发现了一个由 ASA3 亚基N端形成的、沿膜表面延伸约70埃的α螺旋结构。
The high local resolution of the peripheral stalk enabled us to trace with confidence the a carbon chain of subunits ASA1, ASA3, ASA5, ASA6, ASA7, ASA8, ASA9, ASA10, and the proton-translocating subunit a. Densities of bulky aromatic side-chains served as guide points to ensure the correct sequence register (fig. S3). We were able to fit 88.5% of the peripheral stalk subunits, including subunit a, which compares well to the previous 90.8% fit to the single-particle 2.8-Å map (table S1).
图2. ATP合酶四聚体是二聚体排列的重复单元
这些结果为理解线粒体 ATP 合酶的组装机制提供了新的结构基础,有力推动了 ASA 亚基功能的阐明。同时,AFL 技术在膜蛋白复合物结构解析中的成功应用,为其在更广领域的推广奠定了基础。
三、捕获了ATP合成过程中多个旋转催化状态
为了揭示 ATP 合酶在生理条件下的工作机制,研究者在不对称约束的情况下,对 ATP 合酶单体的中心柄和F1区进行了聚焦分类。结果区分出了6个主要的旋转状态和21个亚状态,直接反映了 ATP 合酶在质子驱动下的旋转催化过程(图4)。
To identify distinct catalytically relevant states, we applied symmetry expansion to the subtomogram average of the dimer, followed by focused classification, masking the central stalk of the monomer without imposing C2 symmetry (materials and methods and fig. S5). In this way, we were able to distinguish six principal rotary states, which were further refined to resolve distinct features.
图4. ATP合酶的原位旋转状态
这是首次在完整细胞内实时观测到 ATP 合酶的构象变化,突破了以往体外研究的局限。不同旋转状态的存在,反映了 ATP 合成过程中的能量势垒分布。这些关键的结构信息为理解 ATP 合酶的化学计量学和耦联机制奠定了基础。
四、观察到了c环中心的脂质密度
在 ATP 合酶 Fo 区,研究者观察到了位于 c 环中心的连续密度(图5),推测可能是两个或多个跨膜排列的脂质分子。这一现象此前在牛和绵羊的 cryo-EM 结构中有过报道,提示 c 环的疏水腔在 ATP 合酶组装过程中会被脂质占据。
The clear density in the center of the c ring is most likely due to two or more lipids of the two membrane leaflets arranged tail to tail. In single-particle maps of bovine and ovine ATP synthase, similar densities have been found in the same position (9, 21).
图5. ATP合酶c环及其中心脂质密度
脂质在 ATP 合酶组装和稳定性维持中的作用尚不清楚,这一发现为后续的机制研究指明了方向。同时,c 环中的脂质结合位点也可能成为药物设计的新靶点。
小结
这项工作利用 cryo-ET 和 StA 等技术,在原位条件下以近原子分辨率解析了线粒体 ATP 合酶的精细结构,揭示了二聚体的超分子组装方式与线粒体嵴形成的关系, 捕获了 ATP 合成过程中的多个关键旋转状态,并在 c 环中心发现了全新的脂质结合位点,极大地丰富和深化了人们对 ATP 合酶结构与功能的认识。这些重要发现为 ATP 合酶催化机制和调控通路的研究提供了新的结构基础,有望推动线粒体疾病和衰老研究领域的进一步发展,并为 ATP 合酶靶向药物的设计开发提供新的思路。同时,这项工作在方法学上的创新性尝试,对推动原位结构生物学研究具有重要的示范意义。
研究意义与潜在应用
该研究在接近生理条件下实现了对ATP合酶的高分辨率成像和结构解析,揭示了其独特的空间组织方式和旋转催化机制,加深了人们对其工作原理的理解。这不仅有助于阐明线粒体功能和疾病的分子基础,也为开发针对ATP合酶的药物提供了新的结构基础。
未来,利用类似的方法研究患者来源的线粒体,有望揭示线粒体病变的分子机制。ATP合酶的失调与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关,这项研究为药物筛选提供了新的靶点和评价体系。另外,通过改造ATP合酶,可以赋予其新的催化功能,在生物催化、分子机器等领域具有广阔的应用前景。
作为科研工作者,我们应该关注ATP合酶动态结构与功能的关系,深入研究其调控机制,挖掘新的药物干预途径。同时要发展新的研究工具和方法,提高原位结构分析的通量和精度,拓展到更多的膜蛋白体系,推动膜蛋白药物的研发进程。
未来研究方向与机遇
这项研究虽然取得了重要进展,但仍有许多科学问题有待进一步探索:
ATP合酶不同 旋转状态之间是如何动态转换的?影响转换速率的关键因素有哪些?
ATP合酶超分子复合物的形成机制是什么?这种组装方式如何影响其功能?
线粒体cristae(嵴)的形成与ATP合酶排列有何关联?cristae在调控细胞能量代谢中扮演什么角色?
ATP合酶与呼吸链复合物之间存在怎样的偶联关系?电子传递与质子转运是如何高效协同的?
Critical Thinking
由于technically challenging,目前只能在特定物种的细胞中开展类似研究,在哺乳动物细胞和组织中开展此类研究还面临很大挑战。
FIB样品制备过程可能引入一些人工影响,扰乱ATP合酶的天然状态,需要与其他方法的结果进行仔细比对。
目前的分辨率还不足以观察到一些关键催化中间态和构象变化,需要进一步提高数据质量和处理算法。
实验是在固定的时间点进行的,无法直接反映 ATP合酶的动态变化过程,需要引入时间分辨的成像技术。
研究主要聚焦于ATP合酶,对其与其他呼吸链复合物的互作缺乏足够的关注,需要在更大的背景下分析其功能。
Biosyn导师：Werner Kühlbrandt https://www.biophys.mpg.de/person/102697
Werner Kühlbrandt教授是德国马克斯普朗克生物物理研究所结构生物学部门的主任。他在膜蛋白和膜蛋白复合物的结构与功能研究领域取得了一系列重要成果,是国际公认的结构生物学领域的领军人物之一。
Kühlbrandt教授1981年在英国剑桥分子生物学实验室获得博士学位,师从Nigel Unwin教授,主要从事利用电子显微镜研究二维核糖体晶体结构。博士后期间,他的研究兴趣转向了膜蛋白的结构生物学。1988年,他成为德国海德堡欧洲分子生物学实验室的研究组长,利用冷冻电镜技术解析了植物捕光复合物LHC-II的高分辨率结构,在业界产生了重要影响。
1997年起,Kühlbrandt教授担任法兰克福马克斯普朗克生物物理研究所结构生物学部主任,领导团队利用单颗粒冷冻电镜、冷冻电子断层扫描和X射线晶体学等技术,系统开展膜蛋白大分子复合物的结构与功能研究,在呼吸链复合物、ATP合酶等重要膜蛋白领域取得了一系列突破性进展。
Kühlbrandt教授在膜蛋白结构生物学领域有着深厚的理论功底和丰富的实践经验,尤其擅长将多种技术手段相结合,针对不同的科学问题"量体裁衣",设计出最优的技术路线。他培养了一大批优秀学生,是欧洲结构生物学领域最有影响力的研究团队之一的领军人。同时,Kühlbrandt教授还担任多个重要期刊的编委,在学术界享有很高的声誉。
这项关于线粒体ATP合酶的原位结构研究,正是Kühlbrandt教授多年研究经验的集大成之作。他带领团队将冷冻电镜、分子生物学、生物化学等多种前沿技术与方法学创新性地结合,突破了膜蛋白复合物原位结构研究的技术瓶颈,以近原子分辨率揭示了ATP合酶的精细结构和工作机制,为深入理解生命能量转换奠定了重要基础,相信未来他还将带领团队取得更多引领性的重大突破。
