研究目标及其产业意义
本论文旨在阐明林可酰胺类抗生素生物合成中关键的吡哆醛磷酸(PLP)依赖性酶LmbF和CcbF的反应选择性差异的分子基础。林可酰胺类抗生素(如林可霉素A和天青菌素)对革兰氏阳性菌有很好的抗菌活性,在临床上用于治疗多种感染。然而,这些抗生素的S-烷基部分的结构多样性对其抗菌活性的强弱至关重要。因此,理解LmbF和CcbF催化的不同反应(β-消除和脱羧偶联氧化脱氨)的分子机制,对于利用生物合成策略创造结构更多样、活性更强的新型林可酰胺类抗生素具有重要意义。
Fig. 1 | Biosynthesis of lincosamide antibiotics
正如文章所指出:
Previous structure–activity relationship studies of lincosamides have suggested that S-functionalization of the thiooctose core is important for the strength of antibacterial activity.
新思路、方法及其特点优势
本文运用X射线晶体学解析了LmbF和CcbF的高分辨率晶体结构,并通过对底物进行分子对接和分子动力学模拟,揭示了LmbF和CcbF活性位点的关键残基在控制底物结合模式和反应结果方面的重要作用。此外,作者还利用定点突变和位点饱和突变等手段,对LmbF和CcbF的反应选择性和氧气利用能力进行了理性改造。
相比之前的研究,本文的特点和优势在于:
首次解析了LmbF和CcbF的高分辨率晶体结构,为深入理解其催化机制提供了结构基础。 创新性地运用分子模拟方法,从原子水平上揭示了LmbF和CcbF与底物结合的动态过程和关键相互作用。 巧妙地利用定点突变和位点饱和突变等策略,实现了对LmbF和CcbF反应选择性的定向改造,使其获得新的催化功能(如氧化酰胺化活性)。这为创造结构新颖、活性优异的林可酰胺类衍生物提供了新思路。
作者在论文中也提到:
Remarkably, both LmbF and CcbF variants gained the decarboxylation-coupled oxidative-amidation activity to produce an unnatural S-acetamide derivative of lincosamide.
LmbF和CcbF的高分辨率晶体结构
作者成功解析了LmbF和CcbF的高分辨率(1.7-1.8Å)晶体结构(PDB编号8KDL和8KDK)。两者整体结构高度同源(Cα原子RMSD为1.6Å),均呈现典型的I型PLP依赖性酶折叠。但在底物结合口袋附近,两者的关键残基存在明显差异(图2):
>In the active sites of LmbF and CcbF, the PLP is covalently bound to the catalytic Lys270 and Lys260 residues, respectively, to form internal aldimines (Fig. 2). ... Although the residues lining the active-site cavity are in comparable positions, Asn205, Phe236, Leu83 ′ and Pro302 ′ in LmbF are uniquely substituted with Tyr195, Tyr226, Tyr72 ′ and Tyr292 ′ in CcbF, respectively. These differences are thought to be important for the selectivity of the enzyme reactions (Fig. 2).
图2. LmbF (a)和CcbF (b)的活性位点结构。
高分辨率晶体结构首次在原子水平上揭示了LmbF和CcbF活性位点的精细结构差异,为深入理解其催化选择性差异奠定了基础。这是开展后续机制研究的前提。
分子模拟揭示LmbF和CcbF与底物结合的动态过程
基于晶体结构,作者对LmbF和CcbF与底物S-糖基-L-半胱氨酸(化合物4)的外亚胺中间体进行了分子对接和50 ns的分子动力学模拟。结果表明:
在LmbF中,Asn205和PLP的C3-羟基与底物的羧基形成氢键,使得Cα-H键与PLP吡啶环平行(图3),有利于去质子化生成醌式中间体,进而发生β-消除反应。 >... hydrogen-bond interactions involving the carboxylate group of the cysteine moiety of 4, the C3-hydroxy group of PLP, and Asn205. The dihedral ϕ angle between the Cα–H bond and pyridine ring of PLP is stably maintained around −70° to −90°, indicating that the Cα–H bond is aligned parallel to the p orbitals of the conjugated π-system (Fig. 3a,b).
图3. LmbF与外亚胺中间体的对接和分子动力学模拟。
在CcbF中,Trp140、Asp141与底物的羧基相互作用,使Cα-COO-键与PLP垂直(图4),利于脱羧形成醌式中间体,进一步发生氧化脱氨反应。
In CcbF, His76 interacts with the amide of the substrate, and Trp140 and Asp141 form a hydrogen-bond network with the carboxylate of the cysteine moiety, maintaining an ~90° dihedral ψ angle between the Cα–COO − bond and the pyridine ring of PLP (Fig. 4).
图4. CcbF与外亚胺中间体的对接和分子动力学模拟。
分子模拟从动力学角度揭示了LmbF和CcbF结合底物的构象差异,解释了二者对反应第一步(脱质子vs.脱羧)的不同选择性。这是在静态结构基础上,对酶催化过程的进一步精细刻画。
定点突变验证关键残基的作用
为进一步阐明LmbF和CcbF关键残基的功能,作者进行了系统的定点突变研究。结果表明:
CcbF的Tyr195对第一步反应选择性起关键作用。Y195G突变体更倾向于脱羧偶联氧化酰胺化反应,产生新的S-乙酰胺衍生物(化合物9)(图5a)。
... the CcbF Y195G variant substantially increases the production of 9 (Fig. 5a and Extended Data Fig. 5). The structure of 9 was determined to be the S-acetamide derivative of lincosamide, which has never been reported before
CcbF的Tyr72、Tyr226和Tyr292也参与调控反应选择性。Y72L/Y195G/Y226F和Y72L/Y195G/Y292A突变体则催化β-消除反应,实现了对CcbF功能的改造(图5a)。
Interestingly, the CcbF Y72L/Y195G/Y226F and Y72L/Y195G/Y292A variants completely switched the reaction selectivity to β-elimination, thus converting the catalytic function of CcbF to that of LmbF (Fig. 5a) ...
LmbF的Leu83和Phe236影响β-消除和氧化酰胺化反应选择性。L83Y/F236Y突变体可以催化脱羧偶联氧化酰胺化反应,生成化合物9(图5b)。
... the LmbF L83Y/F236Y variant catalysed the decarboxylation-coupled oxidative amidation to produce 9, as well as the β-elimination reaction (Fig. 5b).
图5. LmbF和CcbF突变体的酶活性检测。a) CcbF及其突变体催化产物的LC-MS检测;b) LmbF及其突变体催化产物的LC-MS检测。
定点突变实验验证了晶体学和分子模拟的预测,确定了调控LmbF和CcbF反应选择性的关键残基。同时,通过定点突变成功实现了酶功能的互换和新活性的创造,展示了蛋白质工程在酶催化新反应开发中的应用潜力。
LmbF和CcbF催化机制的推测
基于晶体结构、分子模拟和突变实验的结果,作者对LmbF和CcbF的催化机制进行了系统总结(图6):
图6. LmbF (a)、CcbF (b)及其突变体(c)的推测催化机制。
LmbF以及CcbF突变体(Y72L/Y195G/Y226F)催化β-消除反应(图6a)。PLP的Lys270从Cα位夺取质子生成醌式中间体,继而Lys270质子化硫醚,裂解C-S键,生成产物6。 CcbF催化氧化脱氨反应(图6b)。底物的Cα-COO-键与PLP垂直有利于脱羧。脱羧后形成的醌式中间体与O2反应,生成半醌自由基和超氧阴离子,进而形成过氧化物中间体。过氧化物消除H2O2和亚胺水解生成醛产物7。 CcbF Y195G突变体可催化新的氧化酰胺化反应(图6c)。脱羧后的醌式中间体与O2反应,过氧自由基进攻Cα或C4′位。经历不同的重排和脱羧过程,最终生成S-乙酰胺衍生物9。
推测的催化机制图对LmbF和CcbF独特的反应选择性给出了合理的解释,也为创造催化新反应的酶奠定了理论基础。这是在实验结果基础上,对PLP依赖性酶催化多样性的新认识。
总结
综上,本文系统阐述了LmbF和CcbF在林可酰胺类抗生素生物合成中催化反应选择性差异的分子基础和结构基础。作者运用多学科交叉的研究策略,重点在以下几个方面取得了突破:
首次解析了LmbF和CcbF的高分辨率晶体结构,揭示了活性位点的精细结构差异; 创新性地运用分子模拟,刻画了两种酶与底物结合的动态过程中构象差异; 系统的突变实验明确了调控反应选择性的关键残基,实现了酶催化功能的定向改造; 在实验结果基础上,提出了LmbF和CcbF催化β-消除、氧化脱氨和氧化酰胺化反应的分子机制。
研究成果的影响、应用及商业价值
本论文的研究成果具有以下几个方面的影响和应用价值:
加深了对PLP依赖性酶催化多样性的认识,为理性设计和改造这类酶提供了新思路。PLP依赖性酶在天然产物生物合成中发挥重要作用,因此这一领域的新发现可以推动合成生物学在天然产物药物开发中的应用。 揭示了林可酰胺类抗生素侧链结构多样性的生物合成基础,为半合成和全合成新型林可酰胺类衍生物提供了重要线索。鉴于S-乙酰胺衍生物(化合物9)的成功获得,未来可以进一步优化LmbF/CcbF突变体,创造更多结构新颖的衍生物,并评价其抗菌活性,发现先导化合物,推动新药研发。 LmbF和CcbF的定向进化和催化新功能的获得,为生物催化剂的理性设计提供了成功范例。相关策略可以推广到其他类型的酶,用于开发新的生物合成路线和工艺,实现药物、精细化学品等的绿色合成。
展望:进一步研究方向与投资机会
基于本论文的研究成果,未来在以下几个方面值得进一步探索:
深入研究LmbF/CcbF突变体的催化机制,阐明氧化酰胺化等新反应的分子基础,为设计catalytic promiscuity更强的突变体提供理论指导。 利用定向进化和理性设计等策略,进一步拓展LmbF/CcbF突变体的底物适用范围,创造结构更加多样的林可酰胺类衍生物库,并评价其生物活性,发现先导化合物。这可能催生出一批高活性、高选择性的新型抗生素。 探索LmbF/CcbF的结晶工程,提高重组酶的稳定性和催化效率,为其在工业生物催化中的应用奠定基础。利用结构生物学和蛋白质工程手段优化酶制剂性能,与合成生物学技术结合,创建绿色、经济的林可酰胺类药物生产新工艺。 将本文的研究思路和方法拓展到其他类型的PLP依赖性酶,以及参与天然产物生物合成的关键酶,建立普适性的酶催化新功能开发策略。这可能孕育出一系列高效、专一的生物催化新工具,推动药物先导化合物发现和绿色合成工艺开发。
Critical Thinking
晶体结构只反映了LmbF/CcbF的一种状态,对酶催化过程中的动态变化,特别是与底物结合诱导的构象变化的描述不够。作者主要通过分子模拟来推测酶-底物复合物的结合模式,但并未通过实验直接表征。这可能影响对某些关键残基作用的判断。 对于LmbF和CcbF反应的中间体和过渡态,作者主要是基于同源蛋白的催化机制进行推测,但缺乏直接的实验证据。虽然作者进行了分子动力学模拟,但并未采用QM/MM等方法对反应能垒进行更精确的计算。因此,有关中间体结构和反应路径的推测还需要进一步验证。 虽然作者获得了催化新反应(氧化酰胺化)的LmbF/CcbF突变体,并鉴定了关键残基,但对突变体的催化效率优化还不够。如CcbF Y195突变体的氧化酰胺化活性与野生型相比还有较大差距。 深入理解突变体结构与功能的关系,进一步提升酶活性,对于其应用前景至关重要。 文章主要关注LmbF/CcbF催化的林可酰胺类化合物侧链引入与修饰反应,对于与之偶联的侧链后修饰过程关注不够。林可酰胺类抗生素的完整生物合成涉及更多的酶促反应和中间体,对其他关键酶及调控机制的研究有助于深入理解其结构多样性的来源。
