研究目标与意义
本研究在2024年8月29日在线发表于Nature Plants。目标是利用化学方法来延长日本牵牛花的花瓣寿命。具体来说,研究人员想要找到能抑制EPHEMERAL1 (EPH1)蛋白活性的小分子化合物。EPH1是一个NAC转录因子,在牵牛花花瓣衰老过程中起关键调控作用。通过筛选和鉴定EPH1抑制剂,研究人员希望能够延缓花瓣衰老,从而延长花朵的观赏期。
这个研究对于园艺产业的发展有重要意义。花卉作物的观赏时间是决定其商品价值的关键因素之一。如果能找到延长花期的有效方法,将极大提升园艺作物的经济价值。此外,揭示花瓣衰老这一发育过程的分子调控机制,也有助于我们理解植物器官衰老的普遍规律。正如论文所述:
In horticulture, however, flower longevity is an important trait that determines the commercial value of ornamental plants, and thus techniques to prolong it are desired.
然而在园艺领域,花朵寿命是决定观赏植物商业价值的一个重要性状,因此延长花期的技术备受期待。
本文的研究思路与方法创新
以往关于花瓣衰老调控机制的研究主要集中在遗传学和分子生物学方面,鲜有利用化学生物学手段进行研究的。本文另辟蹊径,利用高通量筛选技术,在大规模化合物库中筛选EPH1的小分子抑制剂,这在花期调控研究中尚属首次。
全文的研究思路可以概括如下:
建立无细胞蛋白质合成系统,用于体外合成EPH1蛋白
利用AlphaScreen技术建立高通量筛选平台,监测EPH1与DNA的结合能力
利用该平台在9,600个化合物中筛选EPH1抑制剂,并对筛选到的候选化合物进行结构优化
通过生化实验和植物体实验,验证化合物抑制EPH1活性、延缓花瓣衰老的效果
利用RNA测序和基因本体论分析,研究EPH1下游的分子调控网络
这一系列研究中,建立基于AlphaScreen技术的高通量筛选平台是一大创新和亮点。
For the inhibitor screening of EPH1, we used a high-throughput assay system, based on a wheat cell-free system and AlphaScreen technology, to detect direct binding between I. nil EPH1 and its target DNA (Fig. 1a,b).
为了筛选EPH1抑制剂,我们使用了一个基于小麦无细胞系统和AlphaScreen技术的高通量检测系统,用于检测日本牵牛花EPH1与其靶向DNA之间的直接结合。
此外,在对筛选得到的先导化合物进行结构优化时,研究人员发现四氟邻苯二甲酰亚胺骨架对于维持化合物活性至关重要。这为后续开发EPH1抑制剂提供了重要的结构学线索。
The chemical compounds that showed an inhibitory effect on petal senescence shared a tetrafluorophthalimide skeleton.
对花瓣衰老表现出抑制作用的化合物都含有一个四氟邻苯二甲酰亚胺骨架。
实验验证及主要结果分析
本文通过一系列实验,证实了Everlastin1和Everlastin2两个小分子化合物能有效抑制EPH1蛋白的活性,从而延缓日本牵牛花的花瓣衰老。主要的新发现可以总结如下:
1. 建立了基于AlphaScreen技术和小麦无细胞系统的EPH1-DNA相互作用高通量检测平台
这一平台可在体外重构EPH1与靶标DNA的特异性结合,并实现inhibitor的高通量筛选。通过优化,研究人员建立了一个Z′因子高达0.71的稳定筛选体系(图1d),为后续大规模化合物筛选奠定了基础。
To evaluate the quality of the screening system, we calculated the Z′ factor of this system. In general, the system is considered suitable for high-throughput screening if the Z′ factor is greater than 0.5 (ref. 23). ... we found that the Z′ factor, an indicator of the accuracy and quality of high-throughput screening 23 , was 0.71, indicating that this analysis system for EPH1–DNA interaction could be used for high-throughput screening.
图1
2. 从9,600个化合物中筛选出了Everlastin1和Everlastin2两个EPH1的inhibitor
利用上述筛选平台,研究人员从一个含9,600个化合物的Library中筛选到了106个候选inhibitor(图1e)。通过二次筛选和类似物优化,最终确定了Everlastin1和Everlastin2两个四氟邻苯二甲酰亚胺类化合物作为EPH1活性的特异inhibitor(图2d-f)。其中Everlastin1在10 μM浓度下对EPH1-DNA结合的抑制率高达90%以上(图2e)。
图2
From this second screening, three compounds, G1-1, G2-1 and G3-1 (Fig. 1f), were selected. These compounds inhibited the interaction of EPH1 and DNA in a concentration-dependent manner and showed an approximately 65–80% inhibition rate at 10 μM (Fig. 1g).
3. Everlastin1和Everlastin2主要通过抑制EPH1蛋白的二聚化发挥作用
体外相互作用实验表明,Everlastin1和Everlastin2对EPH1与DNA的结合有明显抑制作用,但对EPH1-DBD(DNA结合域)的结合影响较小(图3a),提示两个化合物主要作用于EPH1的C端转录调控区。进一步研究发现,Everlastin1和Everlastin2能显著降低EPH1全长蛋白的同源二聚化水平,但对EPH1-DBD的二聚化无明显影响(图3d)。这表明Everlastin1和Everlastin2主要通过抑制EPH1蛋白的二聚化,进而阻断其与DNA的结合。
图3
These results indicate that Everlastin1 and Everlastin2 inhibit the dimerization of EPH1, predominantly through its C-terminal transcription regulatory domain.
4. Everlastin1和Everlastin2处理能延缓牵牛花花瓣的衰老进程
体内试验表明,外源Everlastin1和Everlastin2处理能明显延缓日本牵牛花花瓣的衰老。如图5所示,DMSO对照组的花瓣在花期24小时后出现明显的失水皱缩症状,而Everlastin1和Everlastin2处理组的花瓣仍保持饱满舒展的状态。伊文思蓝染色、蛋白含量测定和DNA完整性分析等实验进一步证实,Everlastin1和Everlastin2有效抑制了花瓣细胞的程序性死亡进程(图5)。
图5
Everlastin1 and Everlastin2 treatments clearly delayed visible petal senescence. The progression of PCD, which is indicated by decreased protein content, DNA fragmentation and the expression of InSAG12, a senescence marker gene, was suppressed by treatment with these compounds.
5. Everlastin1和Everlastin2在转录水平上抑制了花瓣衰老相关基因的表达
染色质免疫共沉淀(ChIP-qPCR)结果显示,Everlastin1和Everlastin2处理后,EPH1与其靶基因InVPE启动子的结合明显减弱(图4a),提示两个化合物能在体内抑制EPH1的转录活性。RNA测序分析进一步揭示,Everlastin1处理后,与自噬和细胞分解代谢相关的基因普遍下调,而参与蛋白质合成等过程的基因则明显上调(图4b,c),这与推迟花瓣衰老的表型相一致。
图4
RNA-sequencing analysis revealed that the chemical treatment strongly suppressed the expression of programmed cell death- and autophagy-related genes.
ChIP–qPCR assay in Everlastin1- and Everlastin2-treated petals. Extracts from petal segments treated with Everlastin1 or Everlastin2 at t 8 were immunoprecipitated with an anti-EPH1 antibody (EPH1-AB) and pre-immune serum as a negative control (NC), and then VPE DNA enrichment was detected using qPCR.
核心发现概括
总的来说,本研究利用化学生物学手段,通过高通量筛选获得了两个新颖的NAC转录因子EPH1的小分子抑制剂Everlastin1和Everlastin2,并通过体外生化实验和植物体内功能分析,揭示了这两个化合物主要通过阻断EPH1蛋白的二聚化,抑制其与下游靶基因启动子的结合,进而在转录水平上延缓了牵牛花花瓣的衰老进程。这不仅为开发新型花卉保鲜剂提供了候选先导化合物,也为植物衰老研究提供了新的工具和思路。同时,本文还为化学小分子调控植物发育的研究树立了很好的范例。
研究成果对业界的潜在影响
该研究从分子层面揭示了EPH1调控花瓣衰老的机制,为园艺领域提供了全新的理论视角。更重要的是,研究人员鉴定出了两个新颖的、高效的EPH1抑制剂。这为园艺业开发新的保花剂提供了重要的候选化合物,有望大幅度延长花卉作物的观赏时间和货架期。
The compounds identified in this study may serve as a new class of chemical agents that maintain the quality of ornamental flowers.
本研究鉴定的化合物可作为一类新型花卉品质保持剂。
从更长远来看,本研究为植物衰老领域树立了一个很好的范例,展示了如何将化学生物学手段应用于植物发育调控机理的研究。这对于开发新型植物生长调节剂,改良农作物品质和产量,都具有重要的启发意义。科研人员可关注以下几点:
在其他重要的园艺作物中鉴定关键的衰老调控因子,作为新型保鲜剂开发的靶点
优化现有的植物化合物筛选和评价流程,提高筛选效率
研究小分子化合物调控植物发育的分子机制,为作物改良提供新思路
未来研究方向及潜在机遇
本研究在TF(转录因子)靶向药物化学领域取得了突破,为未来进一步研究植物发育调控机制和开发新的植物生长调节剂提供了新思路和新方法。下一步可重点关注以下几个方面:
进一步优化EPH1抑制剂的结构和活性,开发适用于生产条件下的新型保花剂配方。
利用化学方法调控其他植物器官衰老的关键因子,延缓如叶片、果实等器官的衰老,提高农作物产量和品质。
拓展化合物筛选和鉴定体系,针对更多的植物转录因子,尤其是参与重要农艺性状调控的TF进行药物筛选,为农作物改良提供候选先导化合物。
深入研究TF抑制剂的作用机制,了解其在蛋白质和转录水平上的调控网络,为植物生长调节剂的研发提供理论指导。
This drug discovery strategy can be applied to the development of inhibitors for TFs that control other agriculturally important traits, as well as for disease-related TFs in animals.
这一药物筛选策略可应用于针对其他重要农艺性状相关转录因子的抑制剂开发,以及动物疾病相关转录因子的抑制剂开发。
可以预见,随着高通量筛选和表型评价等技术平台的进一步发展,将会有越来越多的植物转录因子抑制剂被开发出来,为我们认识植物复杂的生长发育调控机制,以及开发新型植物生长调节剂提供有力工具。由此带来的农药和肥料减施、作物品质提升所产生的农业和商业价值也将是巨大的。
Critical Thinking
作为首次成功应用化学生物学手段研究花瓣衰老的里程碑式的工作,本研究具有重要的开创意义。不过也有以下几点值得进一步思考:
目前EPH1抑制剂的结构还比较复杂,分子量较大,在开发实用的保鲜剂配方时可能会遇到一些障碍,如成本较高、稳定性欠佳等。进一步优化先导化合物的结构,开发小分子量、高活性的EPH1抑制剂仍有很大的空间。
本研究主要关注了Everlastin1/2对花瓣衰老相关基因表达的影响,对其在表观遗传、蛋白质稳定性等方面的调控机制还缺乏深入分析。
实验中Everlastin1/2对EPH1二聚化的抑制作用还有待更直接的实验证据支持,对其与EPH1结合的具体位点和模式也有待进一步阐明。
本研究重点关注了日本牵牛花这一模式植物,这一策略能否拓展到其他重要的园艺作物,能在多大程度上延长它们的观赏时间,还有待更多的实验研究。
Biosyn导师：Tatsuya Sawasaki https://researchmap.jp/cell-free
基本信息
所属机构:爱媛大学蛋白质科学中心 无细胞生命科学部门 教授 (中心主任)
学位:博士(理学)(广岛大学)
主要研究方向及关键词
Tatsuya Sawasaki教授的研究涉及多个前沿交叉领域,主要包括:
蛋白质降解诱导药物(PROTAC)、撒利度胺(Thalidomide)等分子胶(Molecular glue)的研究
无细胞蛋白质合成系统的开发及应用
蛋白质芯片(Protein array)技术
肿瘤生物学、植物分子生理学等领域的蛋白质功能研究
可以看出,Sawasaki教授的研究主要聚焦于蛋白质合成、功能及调控等方面,尤其擅长利用无细胞表达系统(Cell-free system)进行蛋白质的高通量制备、筛选和分析,在药物研发和植物科学等领域均有创新性的工作。
学术经历
Tatsuya Sawasaki教授于1992-1998年先后在广岛大学理学部和研究生院学习,师从著名植物学家小林道夫(Michio Kobayashi)教授,获得理学博士学位。1998-1999年在爱媛大学化学工程系从事博士后研究。1999年起在爱媛大学工学部任助教,2003年升任无细胞生命科学工学研究中心副教授,2012年成为该中心教授。2013年该中心更名为蛋白质科学中心后,Sawasaki教授继续担任无细胞生命科学部门主任至今。
在无细胞表达领域,Sawasaki教授是国际公认的领军人物之一。他领导的团队开发了多种高效稳定的无细胞蛋白质合成系统,显著提升了蛋白质试验管内制备的产量和应用范围。基于无细胞系统,他们建立了新颖的药物筛选和蛋白质相互作用分析平台,在多个疾病相关蛋白的功能研究及药物发现方面取得了一系列进展。
总的来说,Tatsuya Sawasaki教授是蛋白质研究领域的一位多面手。他以无细胞蛋白质合成为主要研究手段和平台,在蛋白质药物、植物分子生理等多个方向做出了创新性贡献,堪称无细胞生命科学这一新兴交叉学科的开拓者。相信在他的带领下,爱媛大学蛋白质科学中心必将在蛋白质研究领域做出更多原创性、引领性的重要成果。
