论文的研究目标及其重要意义
本论文的研究目标是发现和阐述血红素过氧化物酶(Haem peroxygenases, UPOs)中一种新的催化路径,该路径利用O2和小分子还原剂(如抗坏血酸和脱氢抗坏血酸等)来驱动反应,而非传统的依赖H2O2的催化路径。这对于实际应用和产业发展有重要意义:
Although both UPOs and P450 peroxygenases exhibit obvious advantages as selective oxyfunctionalization catalysts, the catalytic reactions with exogenous H2O2 suffer from the irreversible oxidative inactivation, which largely limits their industrial applications in selective oxyfunctionalization chemistry.
传统的UPOs催化反应依赖外源性H2O2,会导致不可逆的氧化失活,极大地限制了其在选择性氧化官能团化化学中的工业应用。而本文发现的新催化路径,可以避免使用H2O2,从而克服这一难题,具有重要的应用前景。
论文提出的新思路、方法及其特点优势
本论文提出了一种新的UPOs催化路径,即氧气/还原剂依赖型(O2/reductant-dependent)催化路径。与传统的H2O2依赖型和O2/氧化还原伙伴/NADPH依赖型路径相比,该路径依赖于O2在天然存在的小分子还原剂(如维生素C、没食子酸等)存在下的活化。
Unlike the conventional H2O2-dependent or O2/redox-partner/NADPH-dependent routes, this pathway relies on the activation of O2 in the presence of small-molecule reductants such as ascorbic acid (AscA), dehydroascorbic acid (DHA), gallic acid (GA) or pyrogallol (PA) (Fig. 1c). These reductants are naturally available in fresh plant tissue and in lignified tissue.
作者通过实验和计算研究发现,在该路径中,DHA的水合形式DHAA作为关键的共底物,可以活化氧分子生成活性的含氧铁卟啉(oxyferryl haem)中间体Cpd I。此外,该路径在各种血红素过氧化物酶(包括UPOs、CfuCPO、P450s等)中都具有普遍适用性。
该路径的主要特点和优势包括:
利用天然存在的小分子还原剂活化O2,避免了使用H2O2导致的酶失活问题 反应过程中生成的三价铁-过氧化氢中间体Fe(III)–H2O2被很好地限制在酶的活性位点中,可高效转化为Cpd I,避免游离的H2O2造成酶失活 可实现易被H2O2氧化的底物(如槲皮素)的选择性催化转化,传统H2O2体系无法实现 在多种血红素过氧化物酶中都具有普遍适用性,具有广阔的应用前景
利用O2和小分子还原剂实现UPOs催化乙苯羟基化反应
本文作者首先以rAaeUPO催化的乙苯羟基化反应为模型,系统考察了不同小分子还原剂的效果。在抗坏血酸(AscA)存在下,乙苯可以高效转化为(R)-1-苯基乙醇:
rAaeUPO + 1a + AscA
图2
进一步的控制实验表明,该反应需要严格的好氧条件(Fig. 2d),说明反应依赖于O2。18O同位素示踪实验证实,生成物中羟基的氧原子来源于18O2(Fig. 2e),而非缓冲液中的H2O:
Finally, the 18O2 labelling experiment confirmed that the oxygen in the oxidized product originated from the 18O2 (Fig. 2e).
以AscA为还原剂,通过延长反应时间,1-苯基乙醇的产量可达到60 mM以上,对应的TTN高达632,100(Fig. 2f):
Impressively, a remarkable total turnover number of 632,100 ± 37,073 and a concentration of over 60 mM of product was achieved (Fig. 2f).
这些结果首次表明,UPOs可以利用O2和小分子还原剂驱动苯乙烷的羟基化反应,打破了其必须依赖H2O2的传统认知。
DHA及其水合形式DHAA是UPOs催化的实际还原剂
为了鉴定UPOs催化反应的真正电子供体,作者对比了AscA、DHA及其水解产物DKG的还原效果。结果表明,只有DHA表现出明显的促进作用,其性能甚至优于AscA(Fig. 3b):
The results showed that the initial reaction rate reached 144 min−1 in the presence of DHA, which is 58% faster than that observed with AscA. No activity was detected when DKG was used.
图3
进一步加入二硫苏糖醇(DTT)可将DHA还原回AscA。DTT的加入会大大降低以DHA为还原剂的反应活性(Fig. 3e),但对AscA体系的抑制作用相对较弱(Fig. 3d),进一步支持DHA而非AscA才是真正的还原剂。
监测发现,DHA在UPOs存在下的消耗速率远高于AscA(Fig. 3f),提示DHA可能直接进入酶的活性位点参与反应。对照实验也表明,在AscA或DHA存在下,反应过程中实际检测不到过量H2O2的生成(Fig. 3g)。
通过量子力学/分子力学(QM/MM)计算,作者提出了可能的反应机制(Fig. 4)。DHA在水溶液中主要以水合形式DHAA存在,DHAA可通过氢键稳定地结合在酶的活性位点。随后,DHAA上的H原子转移至O2,生成Fe(III)-OOH中间体(2IM1)。DHAA进一步将质子和电子转移至Fe(III)-OOH,生成Cpd 0。最后,质子化的Glu196将质子转移给Cpd 0的远端氧原子,诱导O-O键断裂,生成活性物种Cpd I。
图4
Our QM/MM calculations show that the DHA-mediated oxygen activation by P450SPα follows a similar mechanism to that of the UPO/DHAA/O2 system (Supplementary Fig. 8), suggesting that other analogous enzymes (MroUPO, P450BSβ, CfuCPO, OleTJE) may follow a common mechanism as demonstrated in rAaeUPO and P450SPα.
这些理论计算和实验数据共同表明,DHAA可作为高效的电子供体,活化O2生成Cpd I,为UPOs催化提供新的反应路径。
没食子酸和焦性没食子酸是UPOs催化的天然电子供体
作者进一步考察了木质素降解过程中的天然酚类化合物没食子酸(GA)和焦性没食子酸(PA)对UPOs催化活性的影响。结果表明,GA和PA均可有效驱动乙苯的羟基化反应(Fig. 5b)。机理的理论计算表明,OH可直接将H原子转移给O2形成Fe(III)-OOH中间体(Fig. 5d),与DHAA体系类似。
图5
然而,由于GA、PA在缓冲液中会生成大量H2O2(Fig. 5c, Fig. S12),导致部分UPOs失活,实际催化性能不及AscA/DHA体系。尽管如此,以GA/PA为供电子体系仍表现出良好的底物转化率,表明其在UPOs催化中具有重要作用。
O2/还原剂依赖型催化路径在血红素过氧化物酶中具有普遍性
为了考察O2/还原剂依赖型催化路径的普适性,作者对比了6种不同的血红素过氧化物酶在该体系下的催化活性,包括另一种UPOs酶MroUPO、CfuCPO以及3种P450过氧化物酶(P450SPα、P450BSβ和OleTJE)。结果表明,所考察的酶在添加AscA、DHA、GA或PA后均表现出明显高于传统H2O2体系的催化活性(Fig. 6):
As shown in Fig. 6, reductant-fuelled UPOs exhibited much higher activity than H2O2-dependent reactions (Fig. 6a,b). In the case of CfuCPO, which showed relatively high H2O2 tolerance, only DHA and GA displayed improved catalytic performance relative to the H2O2-dependent process (Fig. 6c). However, for P450SPα- and P450BSβ-catalysed α or β hydroxylation of lauric acid, all the reductant-fuelled reactions exhibited much higher activity than the H2O2-dependent process (Fig. 6c,e).
图6
这些结果明确表明,O2/还原剂依赖型催化路径在血红素过氧化物酶中普遍存在,为酶催化反应提供了一种新的高效驱动模式。
O2/还原剂依赖型催化路径可实现对易被氧化底物的选择性转化
为了凸显O2/还原剂依赖型催化路径的优势,作者以槲皮素为底物,考察了其在不同体系下的反应行为。槲皮素对H2O2极为敏感,容易发生降解。在H2O2体系中,几乎检测不到UPOs催化的C6位羟基化产物。而采用AscA或DHA为还原剂时,槲皮素可以高效地转化为槲皮素没食子醚(Fig. 7):
In the O2/reductant-dependent system with either AscA or DHA, 5a can be selectively hydroxylated at the C6 position to produce quercetagetin (5b) (Fig. 7b,c and Supplementary Fig. 16). By contrast, no C6-hydroxylated product can be formed when exogenous H2O2 is used, leading to the degradation of 5a and the formation of unknown by-products (Fig. 7b).
图7
这一反应实例清楚地展现了O2/还原剂依赖型催化路径在转化不稳定底物方面的独特优势,也为合成槲皮素没食子醚等高附加值产品提供了新的思路。
AscA驱动的UPOs和P450SPα催化剂的放大应用
为了展示O2/还原剂依赖型催化路径的应用潜力,作者放大了AscA驱动的rAaeUPO和P450SPα催化反应。以乙苯为底物,在5 L反应器中通过rAaeUPO催化生成了9.9 g/L的(R)-1-苯乙醇(>99% ee, TTN 395,600; Fig. 8a-c)。同样,以月桂酸为底物,P450SPα催化得到了11.82 g的α-羟基月桂酸(91%收率, TTN 43,760; Fig. 8d-f):
Remarkably, the substrate conversion reached >99%, resulting in 11.82 g of α-OH lauric acid (4b) with an isolated yield of 91%, which corresponds to a catalytic turnover number of 43,760, outperforming previously reported values more than sixfold.
图8
这些放大实验结果充分证明了O2/还原剂依赖型催化路径在合成手性醇、羟基脂肪酸等重要化学品方面的应用潜力,也为发展基于UPOs和P450s酶的工业生物催化工艺指明了方向。
总结
综上所述,本文系统考察了O2和小分子还原剂驱动的血红素过氧化物酶催化新机制,取得了如下主要发现:
UPOs可以利用O2和AscA等小分子还原剂,高效催化苯乙烷的不对称羟基化反应。DHA及其水合形式DHAA是真正的电子供体,可活化O2生成活性物种Cpd I。 没食子酸和焦性没食子酸等木质素降解产物可作为UPOs的天然电子供体,在生理条件下具有重要作用。 O2/还原剂依赖型催化路径在多种UPOs和P450过氧化物酶中普遍存在,显著拓宽了其底物适用范围。 该催化路径可避免使用H2O2,实现对不稳定底物如槲皮素的选择性转化,在合成高附加值的精细化学品方面具有独特优势。 通过放大实验验证了O2/还原剂驱动的UPOs和P450酶催化剂在不对称合成手性醇、羟基脂肪酸等方面的应用潜力。
研究成果可能的影响、应用和商业机会
本论文发现的O2/还原剂依赖型催化路径,克服了传统H2O2依赖型路径的诸多局限,在以下几个方面将产生重要影响和应用:
利用该路径可实现对热敏性、易被氧化的底物(如槲皮素)进行选择性催化转化,这在传统H2O2体系中难以实现。这将大大拓宽UPOs等的底物适用范围和应用领域。 克级规模的转化实验表明,利用该催化体系可以高效制备手性醇、羟基脂肪酸等高附加值的精细化学品,在食品、化妆品、医药等领域具有广阔的应用前景。 本文还证实,O2/还原剂依赖型催化路径在多种血红素过氧化物酶(如UPOs、CfuCPO、P450s等)中具有普遍适用性。这不仅拓宽了该类酶的应用,也为其他血红素酶催化剂的理性设计提供了新的思路。 本文报道的小分子还原剂多为植物体内天然存在的物质,这为开发基于植物组织的绿色催化过程提供了新的机遇。
未来值得进一步探索的问题、挑战及新的机遇
O2活化的分子机制还需进一步阐明。虽然本文提出了可能的机制,但仍需更多实验数据支撑,如活性中间体的捕获和表征等。此外,理论计算还需考虑更多影响因素,以准确模拟酶催化过程。 拓展底物适用范围。目前研究主要集中在苯乙烷、月桂酸等模型底物,未来可探索更多具有应用价值的底物,如天然产物、药物分子、聚合物单体等。这可催生出一系列新技术和产品。 酶催化剂的定向进化。利用定向进化等手段,可进一步提高酶催化剂的活性、选择性、稳定性等性能指标。结合计算模拟和理性设计,有望开发出高效实用的工业级酶催化剂。 开发基于植物组织的催化过程。植物体内富含抗坏血酸、没食子酸等天然还原剂,这为开发无需分离纯化酶的绿色催化过程提供了可能。可以考虑利用农林废弃物等廉价原料,建立高效环保的生物催化工艺。 反应过程强化和放大。为实现工业应用,还需要在反应器设计、传质传热、底物和产物的分离纯化等方面进行系统的工艺优化和放大,以提高生产效率和经济性。
