研究目标与意义
这篇论文于2024年12月11日加速发表于Nature。研究目标是通过解析非核糖体肽合成酶(NRPSs)中关键的缩合(C)结构域在肽键形成过程中的高分辨率结构,揭示其催化机制的细节。NRPSs是合成多种临床重要天然产物(如青霉素、万古霉素等)的重要大分子酶,其中的C结构域负责催化氨基酸单体之间的肽键形成,是NRP合成的关键化学步骤。然而,由于该反应的底物通过活动载体结构域瞬时递送,且通常位于柔性很大的同一蛋白上,因此对C结构域催化机制的研究一直存在很大争议。
正如论文中所说:
The key chemical step in these biosyntheses is amide bond formation between aminoacyl building blocks, catalyzed by the condensation (C) domain. There has been much debate over the mechanism of this reaction.
因此,阐明NRPSs的C结构域催化肽键形成的分子机制,不仅有助于理解这类重要天然产物的生物合成过程,而且可为基于NRPSs的新药研发提供理论基础和技术指导。鉴于NRPs在抗生素、抗肿瘤、免疫抑制剂等药物中的广泛应用前景,该研究对于推动相关产业发展具有重要意义。
创新思路与方法
为解决常规方法难以捕捉C结构域催化瞬时态结构的难题,该研究采用了多种创新策略:
利用非水解底物类似物(nonhydrolyzable substrate analogs)分别修饰NRPSs的两个模块,并通过蛋白质连接(protein ligation)将两部分组装,从而获得稳定的底物/产物结合复合物用于结构解析。这一策略避免了天然硫酯键底物的不稳定性。 在获得供体和受体T结构域分别结合非水解底物/产物类似物后,再利用基因工程的天冬酰胺内肽酶(AEP1)实现两个模块的专一性连接,巧妙地重构了完整的双模块酶用于结晶。 成功解析了肽键形成反应前(pre-condensation)和形成后(post-condensation)两种状态下C结构域与氨酰化T结构域的复合物结构,分辨率分别达2.9Å和3.0Å,揭示了C结构域催化的精细构象变化。 基于高分辨率结构信息,进行了生化实验、定点突变和量子力学模拟计算,从多角度验证了C结构域催化肽键形成的关键残基和可能机制。
以上多种化学生物学和结构生物学方法的创新组合,使得研究者成功捕捉到了完整的NRPS缩合态结构,为阐释其催化机制奠定了坚实基础。相比之前仅获得部分催化元件结合态的研究,该工作在样品制备和结构解析方面实现了重大突破。
一、利用蛋白质连接技术获得NRPS双模块的完整结构
作者首先利用非水解底物/产物类似物分别修饰NRPS的两个模块,然后通过天冬酰胺内肽酶(AEP1)介导的专一性蛋白质连接,获得了携带完整底物的双模块酶,为结构解析奠定了基础。
AEP1 ligation conditions led to ~50% yield of ligated dimodular F1A1T1–C2A2T2 (Figure 1), which could be purified by column chromatography.
关键的是,连接产物具有与天然NRPS相当的肽合成活性(Extended Data Figure 2a),证实了这一人工重构方法的有效性。
Figure 1. Condensation by LgrA and preparation of LgrA condensation complexes
这一创新方法突破了以往研究中底物不稳定、酶蛋白构象异质性大等技术瓶颈,为获得高质量的NRPS-底物复合物结构扫清了障碍,具有重要的方法学意义。
二、首次解析NRPS缩合催化前后的高分辨率结构
在成功制备出稳定均一的双模块NRPS样品后,作者利用X射线晶体学方法,解析了肽键形成反应前(pre-condensation)和形成后(post-condensation)两种状态下NRPSC结构域与氨酰化T结构域的复合物结构,分辨率分别达2.9Å和3.0Å(图2,3)。这是首次在原子水平上清晰展示完整的NRPS"缩合"催化构象。
Figure 2. Structure of the pre-condensation state
高分辨率的电子密度图清晰展现了反应物 fVal-NH-ppant (供体)和 Gly-NH-ppant(受体)分别与C结构域催化隧道两端的精细结合模式(图3a,Extended Data Figure 4):
The ppant moieties each lead from their respective T domains, down opposing sides of the substrate tunnel and into the C domain the active site, where they meet at a near perpendicular orientation (Figure 2b, Figure 3, Extended Data Figure 4)
这一结果直观揭示了NRPS如何将底物精确定位在最佳催化位置,为深入理解其催化机制提供了关键结构基础。
Figure 3. Structures and active site mutagenesis.
该工作克服了底物递送瞬时性和酶构象柔性大的难题,通过底物类似物和蛋白质连接技术巧妙静态捕捉到了完整NRPS两个关键催化状态的结构,在NRPS结构生物学研究中实现了重大突破。
三、阐明C结构域催化肽键形成的关键残基
在高分辨率结构的基础上,作者通过定点突变和动力学实验,鉴定了C结构域中保守的HHxxxDG基序中的两个关键残基His908和Gly913。
突变His908导致酶活性完全丧失:
As expected, the His908Ala mutation resulted in complete loss of activity (Figure 3d).
而突变Gly913也导致酶活性显著下降(图3d)。结构分析表明,这两个残基是唯一与反应物直接相互作用的酶残基,为开展理论计算研究提供了明确的结构基础。
同时,圆二色谱(CD)和差示扫描量热(DSF)实验证实,这些突变并未影响酶的整体折叠和稳定性(Extended Data Figure 6), 表明它们对活性的影响主要源自对化学催化过程的直接参与。多重实验证据的交叉印证,可靠地揭示了C结构域催化的关键元件。
作者进一步分析了酶促反应速率对pH的依赖性,结果表明反应速率在中性pH附近达到最大值并趋于平台(图3f)。这与His908作为关键催化残基的理论预期相一致。
这些实验不仅鉴定了参与催化的必需残基,而且为理论分析提供了重要的结构和动力学线索。它开启了从经典生化到理论计算深入研究NRPS催化机制的新局面。
四、建立量子力学模型揭示新颖的催化机制
为深入探究C结构域的催化机制,作者基于高分辨率结构,构建了包含反应物和关键残基的量子力学模型(theozyme),并进行了从头算分子动力学模拟。
计算结果表明,C结构域采用一种新颖的协同催化机制(concerted mechanism),其中His908并非充当常规的碱催化剂,而是作为关键的氢键受体稳定过渡态:
>Our results indicate that once in reactive position, the acceptor α-amino group attacks the donor thioester moiety. As delineated by the QM, the reaction proceeds concerted pathway in which the His908 imidazole and the Gly913 backbone amine stabilize the transition state, and ends with proton transfer to the thiolate (Figure 5b).
Figure 4. Quantum mechanical calculations
取代实验进一步证实,His908和Gly913对反应能垒的降低和过渡态稳定至关重要(图4)。分子动力学模拟也支持了这一协同催化模型的合理性。
综合实验与理论计算结果,作者提出了NRPS C结构域催化肽键形成的分子机制模型(图5):底物精确定位形成反应构象,His908和Gly913协同稳定过渡态,促进受体氨基对供体硫酯的亲核进攻,最终质子转移到硫基完成反应。
这一研究综合运用结构解析、定点化学、动力学实验和理论计算等多种手段,系统阐明了NRPS C结构域催化肽键缩合的构象基础和分子机制。所揭示的非经典协同催化模型颠覆了传统的"底物辅助催化"理论,丰富了人们对NRPS这类重要酶催化化学的认识。
Figure 5. Mechanism of peptide bond formation
五、深化对NRPS构象动力学调控的理解
除了揭示关键催化步骤的静态结构和分子机制外,作者还系统比较了一系列NRPS结构,深化了人们对其构象动力学调控的认识。
通过比较pre-condensation和post-condensation两种状态以及之前报道的部分态复合物结构,作者发现底物和产物的结合诱导C结构域发生显著的构象重排(图5a,b),但这种诱导契合并非酶催化所必需:
This similarity is notable because NRPSs are highly flexible, so should not necessarily need to adopt one particular overall conformation for condensation, as many positions of F1A1 and C2A2 are compatible with the productive T1:C2 and C2:T2 interactions required in condensation substrate delivery.
分析表明,C、A、T等结构域之间的相对取向可以在很大范围内变化,而不影响催化功能。这突破了之前"诱导契合"催化调控模型的局限,为NRPS构象动力学和结构模块化研究提供了新的视角。
进一步分析发现,尽管NRPS具有很高的整体构象柔性,但T结构域与其他催化结构域对接的界面较为保守(Extended Data Figure 5),这对于理解和重构NRPS的模块功能至关重要:
>Transient interactions between each T domain and the other "side" of their binding site (the less/un-contacted lobe) can be important, but the pattern of these observed interactions have at least two consequences: First (and perhaps trivially), the interaction pattern is opposite of the possible assumption based on the bubble diagrams (Extended Data Figure 5f,g). Second (and most importantly) the described pattern of interaction greatly affects bioengineering strategies: Module-swapping type bioengineering experiments where the cut-point is chosen as between N and C lobes would not be expected to maintain native Tn-1:Cn or Cn:Tn interactions, but would rather introduce more non-native interactions than those with other cut-points.
这些结果为理性设计和改造NPRS提供了新的结构基础和模块界面,有助于优化基于NRPS的非核糖体肽类天然产物的生物合成。
总结
综上所述,这项研究在NRPS结构生物学和催化化学研究领域取得了一系列重要突破:
创新性地运用蛋白质连接技术获得了携带完整底物的双模块NRPS,克服了底物不稳定和酶构象异质性大等技术瓶颈; 首次解析了肽键形成前后NRPS的高分辨率结构,直观揭示了底物在最佳催化位置的精细结合模式; 鉴定了C结构域催化的关键残基,并阐明了His908和Gly913以非经典方式协同稳定过渡态的新颖催化机制; 系统比较分析了NRPS的一系列结构,发现尽管其整体构象较为柔性,但T结构域与其他结构域的对接界面较为保守,深化了对NRPS构象动力学调控的理解。
研究意义与影响
在学术领域,该研究通过精准解析NRPS催化的关键化学步骤,揭示了C结构域催化肽键形成的新机制,颠覆了传统的碱催化理论,丰富了人们对这类重要酶的催化化学认识。这为进一步研究NRPS催化的化学调控、动力学机制和结构进化提供了重要线索。 对于NRPS的定向改造,文中关于T结构域与伴侣结构域对接方式的分析,以及C结构域催化过程中构象调控的阐释,可为优化NRP产物的人工合成提供重要思路。充分理解供体和受体底物的结合模式对于引入新的氨基酸底物、改变肽序列的多样性将大有裨益。 结合X射线晶体学和量子力学计算,创新性地阐明了NRPS中C结构域的催化机理,展示了多学科交叉研究的强大前景。这一研究范式值得在其他复杂生物大分子机器的机制研究中加以借鉴。 NRPs在抗生素、抗肿瘤、免疫抑制剂等多个临床领域有着广泛应用。深入理解NRPS的结构功能和催化调控,有助于开发基于生物合成途径的新型NRPs衍生药物,应对日益严峻的耐药性问题。这将极大拓展NRPs的结构多样性和应用范围,催生出新的药物先导化合物和疗法,造福人类健康。
未来研究方向与展望
阐明更多处于不同催化步骤的NRPSs结构,全面理解其构象动力学变化和底物流动的时空耦联机制。这需要发展更加快速、灵敏的时间分辨结构解析技术。 在原子水平揭示C结构域中不同保守基序的协同催化机制,深化对NRPSs进化出多种催化策略的认识。利用计算模拟和理论分析,阐明不同NRPSs酶的专一性与底物多样性之间的关系,揭示其序列-结构-功能关系的内在规律。这将为定向进化和合理设计NRPSs提供理论指导。 整合结构生物学、合成生物学、代谢工程等多种技术手段,建立基于基因挖掘、酶促合成、宿主发酵的NRPs先导化合物发现和优化平台。充分利用NRPSs的模块化可塑性,定向改造其底物选择性、催化效率和产物多样性,开发出结构新颖、药效显著的NRP类药物分子。 拓展NRPs在农业、功能材料、健康管理等领域的应用。例如,发掘具有植物促生、杀菌除草等活性的NRPs,拓展绿色农用抗生素的种类;开发具有成像、诊疗、给药等功能的多肽纳米材料;富集益生菌合成的免疫调节肽,开发新型健康食品和生物制剂等。这些方向都需要在NRPSs机制解析的基础上,整合多种工程化手段,优化生物合成工艺,提高目标NRPs的产量和质量。 在组学大数据的基础上,利用人工智能算法建立NRPSs的序列-结构-功能预测模型,实现从海量基因资源中快速发掘新型NRPs先导结构的目标。这需要整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据,构建精准的机器学习和深度学习模型,引导后续的实验验证和优化。
[图片] Biosyn导师：Martin Schmeing
https://www.mcgill.ca/sbms/martin-schmeing
Thomas Martin Schmeing是加拿大麦吉尔大学生物化学系的James McGill讲席教授,也是麦吉尔结构生物学研究中心(CRBS)的科学主任。
Schmeing教授的研究方向主要集中在利用X射线晶体学和电子显微镜研究大分子机器的结构。他的实验室对执行重要细胞过程的大分子机器特别感兴趣。这些酶通常需要超分子组织和复杂的结构才能发挥功能。例如,一些酶需要使用超过100,000个原子来形成肽键,而打破这些键的蛋白酶却可以非常小。当然,这些组装体需要调节、连续性和忠实度,这些都导致了它们尺寸的增加。Schmeing实验室既研究细胞机器实现这些功能的方式,也研究它们的主要功能机制。为此,他们结合使用X射线晶体学、电子显微镜和生物化学技术。
Schmeing实验室的主要研究对象是非核糖体肽合成酶(NRPS)。NRPS是催化肽键形成的大分子机器。这些巨型酶不是合成蛋白质,而是产生具有重要且多样生物活性的大量小分子。例如,NRPS可以合成抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、铁载体和免疫抑制剂,包括众所周知的青霉素和环孢菌素等化合物。NRPS采用装配线逻辑,对于添加到多肽的每个氨基酸都有移动部件和专用活性位点。NRPS的分子量可以超过2兆道尔顿,是自然界中最大(也是最有趣!)的酶。
