研究目标与意义
这项研究的主要目标是开发一种新颖的生物催化平台,将光氧化还原催化与金属酶催化相结合,实现非天然的对映选择性自由基转化反应。具体来说,研究人员希望利用绿光照射下的曙红Y(Eosin Y)光催化剂,驱动4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)催化N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯(N-hydroxyphthalimide esters)的脱羧叠氮化和硫氰化反应。
论文中这样阐述研究目标:
Here we present a biocatalytic platform that combines photoredox and metalloenzymatic catalysis for enantioselective radical transformations. Under green light irradiation, the eosin Y photocatalyst enables 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenases to catalyse enantioselective decarboxylative azidation and thiocyanation of N-hydroxyphthalimide esters.
金属酶在自然界中发挥着重要的催化作用,但其在合成催化方面的应用还很有限。近年来,研究人员通过重新编程天然金属蛋白,使其能够催化无生物等价物的反应,大大拓展了酶催化的范围。但是迄今为止,金属光氧化还原催化这一过渡金属催化的关键反应在生物催化领域仍处于欠发达状态。该研究旨在建立一种将光氧化还原自由基生成与金属酶对映选择性自由基捕获相结合的新型生物催化方法,拓宽金属酶催化自由基反应的范围。
这一研究填补了酶催化脱羧叠氮化反应的空白,为酶催化剂的设计提供了新思路。同时,脱羧叠氮化是一类重要的有机转化反应,能将广泛存在的羧酸(或其衍生物)转化为具有高衍生化能力的有机叠氮产物。其对映选择性版本的发展将有助于获得手性叠氮化合物,在合成化学和药物发现领域具有广阔的应用前景。因此,该研究对于推动酶催化、不对称合成等领域的发展具有重要意义。
创新思路与方法
本文提出了一种新颖的生物催化策略,将光氧化还原催化引入到金属酶体系中,实现非天然的对映选择性自由基转化反应。与之前方法相比,该策略具有以下创新点和优势:
首次将光氧化还原催化与金属酶催化相结合,克服了金属光氧化还原催化在生物催化领域发展滞后的问题。传统的光生物催化主要集中在含有有机辅因子(如黄素、烟酰胺、硫胺素和吡哆醛)的酶,本研究则拓宽了光生物催化的酶种类。 巧妙利用了非血红素铁酶丰富的反应性中间体,如高价铁-氧复合物,实现自由基转化。通过对20种有代表性的非血红素铁酶进行对接研究和筛选,发现4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(SavHPPD)与曙红Y光催化剂的组合能够高效催化目标反应。 采用定向进化策略,通过饱和突变和筛选,获得了性能大幅提升的SavHPPD变体酶。研究人员对靠近底物对接位点的7个氨基酸残基进行了饱和突变,并经过4轮筛选,获得了对映选择性和催化效率显著提高的四重突变体SavHPPD-PC。 从机理上阐明了反应的关键步骤。一方面,蛋白催化剂促进光催化剂与铁中心之间的单电子转移,可能是由于酶存在下两者距离更近。另一方面,引入的S230Y突变通过形成疏水口袋容纳叠氮基团,并协助底物自由基苯基与铁中心对齐,从而实现高效对映选择性的C-N3键形成。 该方法的底物适用范围广,对芳香族和脂肪族的仲/叔碳都能实现对映选择性叠氮化,最高获得77%产率、97:3 e.r.和385 TTN。此外,通过将叠氮替换为硫氰酸盐,还实现了脱羧硫氰化反应,突显了该平台发展新型金属酶催化自由基反应的潜力。
Fig. 1 | The design of a photobiocatalytic platform for decarboxylative functionalization.
本研究发展了一种全新的酶催化自由基反应模式,很好地融合了合成光氧化还原催化的优势和酶催化的多样性与适应性。这为开发高效的生物催化方法提供了新的思路和范例。
《利用光驱动的金属酶催化实现高对映选择性自由基脱羧叠氮化》
这篇发表于《Nature Catalysis》的论文报道了一种突破性的生物催化新策略,将光催化与金属酶催化巧妙结合,成功实现了NHPI酯的高对映选择性脱羧叠氮化和硫氰化反应。研究者通过系统的实验和理论计算,取得了一系列关键性新发现,极大地拓展了酶催化自由基不对称转化反应的范围。下面将依次介绍这些重要结果。
建立了一种新型光驱动非血红素铁酶催化自由基转化反应
通过将光氧化还原催化引入金属酶体系,作者发展了一种全新的生物催化模式,突破了金属光氧化还原催化在生物催化领域应用欠缺的瓶颈。作者对20种非血红素铁酶进行分子对接分析和实验筛选,发现SavHPPD酶与曙红Y光催化剂的组合在绿光照射下可以有效催化NHPI酯的脱羧叠氮化反应,获得140 TTN和70:30 e.r.。这是首次在非血红素铁酶中实现底物自由基的对映选择性转化,为酶促不对称自由基反应开辟了全新途径。
Here we present a biocatalytic platform that combines photoredox and metalloenzymatic catalysis for enantioselective radical transformations.
Our screening revealed that multiple combinations of non-haem iron enzymes and photocatalysts exhibited initial activity towards the target reaction (Fig. 2a and Supplementary Table 1). The most promising result was achieved with 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from Streptomyces avermitilis (SavHPPD) as the enzyme catalyst and eosin Y as the photocatalyst. Under green light irradiation, this catalyst combination produced the azidation product with 140 total turnovers (TTN) and 70:30 enantiomeric ratio (e.r.).
Fig. 2 初始酶活性发现。(a)提出的光生物催化脱羧叠氮化反应的初步活性。(c)SavHPPD定向进化过程中鉴定的代表性变体。
通过定向进化获得了高性能SavHPPD变体酶
针对SavHPPD酶的对映选择性和催化效率,作者采用饱和突变和高通量筛选策略对其进行了四轮定向进化。通过对酶活性位点附近的7个氨基酸残基进行突变组合优化,最终获得了性能大幅提升的四重突变体SavHPPD-PC,可将目标反应的TTN提高至200,e.r.提高至94:6,是原始酶的1.4倍和1.3倍。而且在此过程中鉴定出了多个关键突变位点(如V189A、S230Y等),它们协同作用显著改善了叠氮基团的结合和手性控制。这些结果表明,通过理性设计和定向进化可以快速改造非血红素铁酶,获得与天然酶相媲美的催化性能,为开发新型生物催化剂提供了有效途径。
Based on SavHPPD V189A/S230Y, additional rounds of SSM and screening afforded a final quadruple mutant, SavHPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A (hereafter referred to as SavHPPD-PC), that could carry out the target reaction with 200 TTN and 94:6 e.r.
实现了各类NHPI酯底物的高效对映选择性叠氮化
在获得高性能SavHPPD-PC酶后,作者考察了该酶对各种NHPI酯底物的普适性。结果显示,无论是芳香族还是脂肪族的伯/仲/叔NHPI酯,均能在优化条件下高效转化为相应的叠氮化产物,获得高达77%的产率、97:3的e.r.和385的TTN。其中芳香族底物的适用性最好,邻/间/对位取代的苯环都可以很好地容纳;脂肪族底物的位阻适应性较差,但对仲碳底物仍能实现77:23的对映选择性。总的来说,该方法的底物适用范围广,官能团兼容性好,极大地拓宽了酶促不对称叠氮化反应的合成化学空间,为手性叠氮化合物的制备提供了新的思路。
With the optimized reaction conditions in hand, we examined the substrate scope of this photobiocatalytic reaction (Fig. 3). Substrates featuring halogen, methyl and methoxy groups on the phenyl ring were well tolerated, yielding azide products with up to 385 TTN and 97:3 e.r.
We subsequently assessed how our system performs with NHPI esters derived from primary, secondary and tertiary aliphatic acids. These substrates present challenges due to the slower decarboxylation rates of the corresponding carboxyl radicals and the reduced stabilization of the resultant C(sp3) radicals. Our results demonstrated that, for these challenging substrates, the reaction could proceed and afford the azidation products with 27–124 TTN (20–24). A 77:23 e.r. was achieved for a secondary azide product 23.
Fig. 3 光生物催化脱羧叠氮化和硫氰化反应的底物范围。
阐明了该反应的关键催化机制
作者通过系列理论计算和光谱学实验,对该酶促自由基反应的分子机制进行了深入研究。动力学同位素实验表明,酶可能有效地结合R和S构型底物并将其转化为外消旋的自由基中间体。电子顺磁共振和Stern-Volmer淬灭实验证实,在有底物存在时,光激发的曙红Y与酶结合并将Fe(II)氧化至Fe(III),形成高自旋的Fe(III)-N3物种。结合分子动力学模拟可以推测,该反应经历了光催化剂到金属中心的长程电子转移,然后还原态的曙红Y活化NHPI酯产生碳自由基,再被三价铁-叠氮加合物高效捕获生成目标产物。同时S230Y等关键突变通过疏水相互作用帮助底物自由基与金属中心对齐,从而实现对映选择性控制。这些机理研究加深了我们对酶促光氧化还原催化过程的认识,为后续催化剂的理性设计提供了重要依据。
Mechanistic studies suggest that the reaction proceeds through the initial oxidation of the Fe(II) centre to Fe(III) by photoexcited eosin Y, followed by a second SET from reduced eosin Y to the NHPI ester, generating a C(sp³) radical. This process is facilitated by the binding of the photocatalyst to the protein surface, positioning it within 20 Å of the iron centre to enable long-range electron transfer.
Further computational studies on the azide transfer step revealed two critical roles of the S230Y mutation in this process. First, it forms a hydrophobic pocket with P243 and F359 to accommodate azide and direct it trans to the H270 residue (Supplementary Figs. 4–7), which is reminiscence of the hydrophobic halide binding cavity observed in natural non-haem iron halogenases. Second, it assists in aligning the phenyl moiety of the benzylic radical towards the iron centre, potentially through π–π stacking or hydrophobic interactions (Supplementary Fig. 9). These structural alignments position the si face of the substrate radical towards the iron-bound azide, leading to the 'S' absolute configuration of the final product (Fig. 4f and Supplementary Fig. 8).
Fig. 4b 电子顺磁共振研究Fe(III)积累。红色曲线表示模拟光谱。
Fig. 4f 活性位点残基与底物自由基之间的关键相互作用,生成S构型叠氮化产物。
通过调节核移基团实现了脱羧硫氰化反应
作者在成功实现酶促脱羧叠氮化的基础上,进一步将叠氮替换为硫氰酸盐,考察了该催化平台对其他类型自由基转化反应的适用性。令人欣喜的是,在优化的SavHPPD-PC酶催化下,脱羧硫氰化反应也能顺利进行,对芳香族和脂肪族底物均表现出良好的反应性,最高获得114 TTN和78:22 e.r.。虽然对映选择性还有待进一步提高,但这一结果证明了该方法的普适性,为酶促自由基不对称转化反应的多样化发展提供了新思路。通过引入不同的亲核试剂与自由基加成,有望实现更多新颖的C-X键构建反应。
Nevertheless, enzymatic activity was observed when azide was replaced by thiocyanate (25–29), producing decarboxylative thiocyanation products with 45–114 TTN and 56:44–78:22 e.r. Despite moderate enantioselectivity, these results mark an appealing instance of biocatalytic radical C(sp3)‒SCN bond formation and highlight the potential of this biocatalytic metallophotoredox strategy to develop new metalloenzymatic radical reactions.
这项突破性研究建立了一种新颖的酶促光氧化还原催化策略,通过将光催化自由基产生与金属酶的对映选择性自由基捕获相偶合,成功实现了NHPI酯类化合物的高对映选择性脱羧叠氮化和硫氰化反应,极大地拓宽了酶促自由基不对称合成的范畴。该工作不仅在反应类型、催化机制、实用性等方面取得了系列重要发现,为绿色合成化学和生物催化领域的发展提供了新的思路和方法,也为后续开发高效手性催化剂奠定了重要基础。相信这一策略能够在更广范围内得到应用,催生出更多新颖高效的酶促自由基转化反应,最终造福于可持续发展的化学工业。
研究意义与潜在应用
这项研究将给生物催化和有机合成领域带来重要影响。其主要意义体现在以下几个方面:
建立了一种全新的生物催化范式,为开发新型金属酶催化反应提供了普适性策略。通过将丰富多样的合成光催化方法与金属酶的多样性和适应性相结合,有望大大拓宽酶催化反应的类型。 首次实现了酶催化的脱羧叠氮化反应,填补了这一重要转化在生物催化领域的空白。这不仅为合成手性有机叠氮化合物提供了高效、环境友好的方法,也为发展其他类型的酶促脱羧官能化反应提供了重要启示。 证实了非血红素铁酶在不对称催化领域的巨大潜力。通过定向进化,研究人员将SavHPPD酶改造成了一个高效的手性合成工具,并实现了对一系列芳香族和脂肪族底物的对映选择性转化,最高获得97:3 e.r.。这为开发非血红素铁酶参与的不对称催化反应提供了很好的模版。 展示了将叠氮替换为其他亲核试剂(如硫氰酸盐)参与的自由基偶联反应的可能性。尽管目前对映选择性还有待提高,但这预示着该催化平台在发展新型金属酶催化自由基反应方面具有广阔的应用前景。
未来研究方向与机遇
尽管该研究取得了重要进展,但在该领域仍有许多问题和挑战值得进一步探索,主要包括:
反应机理的深入理解。目前对酶促自由基反应的微观机制了解还不够深入,特别是酶环境对自由基行为的调控作用有待澄清。需要综合运用计算模拟、光谱学表征等手段,从原子和分子水平阐明反应的关键步骤和决速因素,并揭示酶的结构与功能之间的内在联系。这将为设计高效的生物催化剂提供重要的理论指导。 人工金属酶的定向设计与优化。尽管定向进化是一种强大的酶改造策略,但其依赖于高通量筛选,成本较高且耗时较长。未来可以发展基于机器学习和计算机辅助设计的智能定向进化技术,加速人工金属酶的优化进程。此外,将非天然氨基酸、金属有机骨架等新型分子嵌入到酶骨架中,有望获得具有超常catalytic activity和稳定性的人工金属酶。 酶促自由基反应的底物拓展。目前该方法对芳香族和不饱和脂肪族底物的适用性较好,而对于饱和脂肪族底物,特别是位阻较大的叔碳底物,反应效率还有待提高。未来可以通过酶结构改造,如扩大活性口袋或引入辅助结合位点,以适应不同类型和位阻的底物分子。此外,还可以发展与光催化剂互补的新型电催化体系,实现电化学驱动的酶促自由基转化。 手性化合物的合成应用。将该方法应用于复杂手性分子和天然产物的不对称合成,是一个很有前景但也充满挑战的方向。这需要开发出底物适用范围更广、对映选择性更高的酶催化系统,并与化学合成方法巧妙结合,实现药物分子、农用化学品、功能材料等的高效制备。这将极大地推动相关产业的发展。
工业放大与过程优化。将酶促光催化体系扩大到工业生产规模,需要在酶催化剂的制备、反应过程工程、产物分离纯化等方面进行系统优化和集成创新。例如,发展酶固定化技术以提高酶的稳定性和可重复利用性;优化光照反应器的设计以实现光能的高效利用;开发连续流动反应技术以提高生产效率等。这些都为过程工程师和化学工程师提供了新的研究机遇。
Critical Thinking
对映选择性的位点和调控机制还不甚清楚。目前的分子动力学模拟结果初步提示了一些关键残基在底物结合、自由基转化过程中的作用,但还缺乏深入的实验验证。需要通过更精细的计算模拟、结构解析、动力学同位素效应等研究,阐明手性传递和调控的分子机制。 底物适用范围还有待拓宽。目前对于脂肪族底物,特别是位阻较大的叔碳底物,反应效率和对映选择性都还不够理想。而芳香族底物的适用性也局限于对位取代的NHPI酯,邻位和间位取代底物的反应性还有待考察。未来需要在酶结构改造和反应条件优化方面下更多功夫,以适应更广泛的底物类型。 反应条件还不够温和,不利于放大应用。目前反应需要较强的光照条件(两个高功率LED灯)和较长的反应时间(16 h),成本较高且不易放大。此外,反应体系中的有机溶剂(如DMF)的用量也偏高,不够环保。未来需要进一步优化反应体系,降低光照强度和反应时间,并尽量减少有机溶剂的使用,以提高其工业应用潜力。 与化学催化方法相比,酶催化体系的效率和成本优势还不够明显。目前已有多种化学催化体系可以高效实现脱羧叠氮化反应,且其底物适用性和对映选择性调控能力可能更强。未来需要在酶催化剂的制备成本、催化效率等方面进行更有针对性的优化,同时充分发挥其温和条件、环境友好等独特优势,以体现出其相对于化学方法的优越性。
