论文的研究目标及其重要意义
本文于2024年12月11日在线发表于Nature Catalysis。研究目标是通过在大肠杆菌(Escherichia coli)细胞表面进行原子转移自由基聚合(Atom transfer radical polymerization, ATRP),将催化性聚合物接枝到活细胞膜上,实现可循环的光酶催化(Photoenzymatic catalysis)。这种新颖的方法有望克服当前在工程化细胞膜用于催化时面临的挑战,
如:
In nature, cells have evolved to assemble catalytically active biomacromolecules within their membranes, facilitating a multitude of enzyme-mediated reactions that underpin essential cellular functions. ... Addressing these limitations, researchers have developed genetic and chemical engineering strategies for incorporating biomacromolecules of interest—from natural to artificial enzymes—onto cell surfaces for catalytic purposes, ... Despite considerable progress, engineered membrane-associated biomacromolecules typically exhibit low expression levels compared to recombinant enzymes within cells, leading to an insufficient supply of catalysts. Furthermore, their stability is often compromised due to direct exposure to environmental stresses such as ultraviolet (UV) radiation, organic solvents and high temperatures, which are common in industrial processes.
天然细胞膜上装配了多种具有催化活性的生物大分子,介导了大量的酶促反应。但人工改造细胞膜用于催化存在表达水平低、稳定性差等局限性。本文提出的细胞表面聚合物修饰策略,有望在合成化学、高分子化学和生物技术领域开辟新的前景:
Consequently, our findings provide an efficient strategy for the seamless integration of cellular and chemical catalysts to achieve robust photoenzymatic catalysis and recyclability, opening a horizon in the realms of synthetic chemistry, polymer chemistry and biotechnology.
论文提出的新思路和方法
本文提出了一种化学改性细胞膜的聚合物策略,通过在活细胞膜上进行ATRP聚合,将具有催化功能的聚合物(如含有蒽醌和钌配合物的聚合物)接枝到大肠杆菌表面,同时在细胞内表达异源酶。与之前方法相比,该策略有以下特点:
利用ATRP在活细胞表面原位聚合,无需繁琐的后处理步骤,操作简便高效。 聚合物能保护细胞免受外界环境如有机溶剂、高温等的破坏,提高催化稳定性。 表面聚合物与胞内酶协同,实现化学-酶串联催化,提高反应速率和产率。 细胞作为微米级生物支撑体,便于催化剂的回收循环利用。
为了验证聚合物的成功修饰,文章使用了多种表征手段:
The successful incorporation of the polymer P1 was confirmed through UV–visible (UV–vis) spectroscopy, which showed a distinct absorption feature of its constituent monomer M1 at 328 nm (Fig. 2c). ... Additionally, thermogravimetric analysis (TGA) showed greater weight loss with increasing polymer loading (Supplementary Fig. 8). Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy showed a peak around 1,750 cm −¹, corresponding to the C=O stretching vibration from the synthetic polymer on the cells (Supplementary Fig. 9).
通过紫外-可见光谱、热重分析、红外光谱等方法证实了P1聚合物的成功接枝。此外还利用荧光共聚单体M3,通过结构光照明显微镜(SIM)和受激发射损耗显微镜(STED)观察到聚合物在细胞膜上均匀分布。
本文巧妙地利用表面ATRP聚合和胞内酶表达相结合,为工程化细胞膜催化提供了新的策略。设计思路新颖,实验验证全面详实。
1. 聚合物在大肠杆菌表面的成功接枝及表征
通过一系列表征手段,作者证实了聚合物P1成功接枝到大肠杆菌表面:
The successful incorporation of the polymer P1 was confirmed through UV–visible (UV–vis) spectroscopy, which showed a distinct absorption feature of its constituent monomer M1 at 328 nm (Fig. 2c). ... Additionally, thermogravimetric analysis (TGA) showed greater weight loss with increasing polymer loading (Supplementary Fig. 8). Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy showed a peak around 1,750 cm−¹, corresponding to the C=O stretching vibration from the synthetic polymer on the cells (Supplementary Fig. 9).
紫外-可见光谱在328 nm处出现明显的M1特征吸收峰(图2c);热重分析表明聚合物负载量越高,失重越大;红外光谱在1750 cm-1附近出现C=O伸缩振动峰,进一步证实了聚合物的接枝。
此外,通过调节单体M1的投料比,可控制聚合物的接枝量,获得高、中、低三个不同聚合修饰水平的大肠杆菌。这为后续研究奠定了基础。
2. ATRP聚合和表面聚合物对细胞活性和增殖的影响
研究发现,ATRP聚合过程和接枝聚合物对大肠杆菌细胞的活性、形态和增殖能力影响很小:
No differences were detected in the growth curves and agar plates among native, initiator-modified and polymer-grafted E. coli cells, indicating that the intrinsic cellular proliferation remains unimpeded by the ATRP process and the presence of grafted polymers (Fig. 3h–j and Supplementary Fig. 17).
天然细胞、引发剂修饰细胞和聚合物接枝细胞在生长曲线和琼脂平板上均未见明显差异(图3h-j),表明ATRP过程和表面聚合物并未影响细胞的固有增殖能力。
此外,透射电镜和扫描电镜也证实聚合物接枝前后细胞形态无明显变化。这些结果证明了该聚合物修饰方法的生物相容性,有利于保持细胞的催化活性。
3. 聚合物对细胞和酶在极端环境下稳定性的保护作用
在有机溶剂、强酸、紫外辐射、高温等恶劣条件下,聚合物修饰细胞展现出明显的稳定性优势:
polymer-grafted cells exhibited over 83% viability, as determined by the live/dead assay (Fig. 5b). By contrast, native cells demonstrated minimal survival under the same conditions (Fig. 5a). ... CalB in polymer-grafted cells retained over 70% of its original activity, while native cells only preserved less than 35% of their activity (Fig. 5f).
活死染色表明,聚合物修饰细胞在甲苯/水界面处理后仍保持83%以上的存活率(图5b),而天然细胞几乎全部死亡(图5a)。CalB酶在聚合物保护下可保持70%以上活性,天然细胞中的酶活性损失超过65%(图5f)。类似结果在其他胁迫条件下也得到证实。
这些发现突破了以往工程化细胞催化的稳定性瓶颈,为极端环境下的生物催化提供了新的技术方案。表面疏水聚合物形成的微环境对酶的稳定和保护至关重要。
4. 光酶串联催化性能的显著提升
在苯甲醇到扁桃醛的光酶串联反应中,以聚合物P1和苯甲醛裂解酶(BAL)共同修饰的大肠杆菌展现出最佳催化效果:
The highest product yield was realized with M-polymerization, in comparison to the lower yields attained with L- and H-polymerization, respectively (Supplementary Fig. 25). ... The polymer-grafted cells outperformed the controls, generating 18 mM benzoin, a yield 9 times higher than the monomer-cell mixture and 15 times greater than the polymer-cell mixture (Fig. 6b).
中度聚合修饰的细胞催化效果最佳(图S25)。与聚合物/细胞、单体/细胞简单混合的对照组相比,聚合物接枝细胞的扁桃醛产量分别提高了15倍和9倍,高达18 mM(图6b)。进一步将细胞浓度提高到OD600=6.0时,产量可达34.4 mM。
研究者将性能提升归因于聚合物和酶的协同效应:细胞膜的疏水微环境促进光催化氧化,表面聚合物保护胞内酶,两者在空间上紧密耦合,加速了中间体向产物的转化。
此外,聚合物修饰细胞催化剂可方便地通过离心回收,重复使用6次活性无明显下降(图6f)。这一发现突破了酶促反应后处理难、催化剂回收成本高的技术瓶颈,为化学酶法合成开辟了绿色、经济的新路径。
图6f 聚合物修饰细胞催化剂的重复使用性能5. 钌-聚合物修饰细胞在化学酶催化中的应用
为拓宽细胞表面聚合物修饰策略的适用性,研究者进一步设计了含钌配合物的聚合物P2,接枝到表达胺基转移酶(ATA)的大肠杆菌表面,考察其在α-甲基苄胺不对称还原中的催化性能。
能量色散X射线(EDX)分析证实了金属钌在细胞表面的成功引入(图7b,c)。在α-甲基苄胺还原为手性醇的串联反应中:
the polymer-grafted cells reached a product concentration of 25 mM, considerably higher than the control groups, which yielded less than 1 mM (Fig. 7j). Moreover, the hybrid catalysts were recyclable for six cycles without significant loss of catalytic activity (Fig. 7k).
P2修饰细胞的产物浓度高达25 mM,明显优于对照组(<1 mM)(图7j)。且杂化催化剂可循环使用6次而活性无明显下降(图7k)。这一结果进一步拓展了聚合物修饰细胞催化策略在不对称合成中的应用前景。
6. 核心发现总结
综上所述,本文的核心发现可概括为:
通过可控的表面ATRP聚合,在大肠杆菌细胞表面接枝催化性聚合物,构建了一种新型的"细胞-聚合物"杂化催化剂。该催化剂在有机溶剂、强酸等极端环境下展现出优异的稳定性,可显著提升胞内外串联催化反应的效率,实现催化剂的简便回收和循环利用。这一策略适用于不同的聚合物体系和生物转化反应,为化学-酶法合成开辟了新的途径。
本文巧妙地将聚合物化学与合成生物学相结合,在方法学和应用研究方面均取得了重要突破,很好地解决了工程化细胞催化普遍面临的稳定性差、后处理难等关键问题。这些发现极大地拓宽了生物催化剂的应用范围,为可持续合成化学的发展提供了新的技术支撑。
论文的研究成果对业界的影响和潜在应用
本文提出的细胞表面聚合物修饰策略,为克服工程化细胞膜催化面临的瓶颈问题提供了新的解决方案。细胞膜疏水微环境的利用,聚合物对细胞和酶的保护作用,以及两者在空间上的紧密耦合,共同促进了化学-酶串联反应的高效进行。基于这一策略发展的"细胞-聚合物"杂化催化剂,兼具生物催化剂的高选择性和化学催化剂的稳定性,在生物转化、合成化学、制药等领域具有广阔的应用前景,有望实现高附加值化合物的绿色制造。
作为科研人员,我们应该着重关注以下几点:
细胞表面聚合物的分子设计。引入新的催化基团,优化聚合物组成和结构,以进一步提高催化活性和选择性。 聚合物修饰方法的优化。探索更温和、高效的细胞表面接枝聚合策略,扩大适用的细胞和酶种类。 生物相容性评估。系统考察表面修饰对细胞生理功能的影响,发展高度生物相容的聚合物体系。 催化过程强化。借助反应工程的理论和方法,优化细胞-聚合物杂化催化剂的使用条件和工艺参数,进一步提升催化效率。 制备工艺放大。探索修饰细胞催化剂的规模化制备工艺,为产业应用奠定基础。 新型催化反应和产品的开发。充分发挥"细胞-聚合物"杂化催化体系的优势,设计开发新颖的串联反应路线,合成结构新颖、功能独特的高附加值化合物。
未来研究方向、问题及挑战
基于本文的研究成果,未来在该领域值得进一步探索的问题和挑战主要有:
智能响应型聚合物的设计与构建。引入对温度、pH、光照等环境因素响应的基团,实现聚合物结构和催化性能的可控调节,为复杂条件下的催化提供新的思路。 稳定性和循环使用性能的提升。进一步优化聚合物的组成和修饰方法,最大限度地提高"细胞-聚合物"杂化催化剂的稳定性,实现长期、多次使用,提高生物催化过程的经济性。 手性催化的拓展。在聚合物中引入手性基团,利用空间位阻效应,对不对称合成反应的立体选择性进行调控,实现高对映选择性的手性催化。 多酶级联催化的构建。在单个细胞表面共价固定多种酶,实现复杂生物合成途径的整合和优化,大幅度缩短反应步骤,提高生产效率。这对天然产物、药物分子等的生物合成具有重要意义。 细胞生理学机制的深入理解。表面聚合物接枝可能对细胞的生长代谢产生影响,需要在分子水平上阐明其作用机制,优化修饰策略,实现高度协同的"细胞-聚合物"界面。这需要生物学和材料学的交叉融合。 产业化应用的挑战。实现"细胞-聚合物"杂化催化剂的规模化制备和应用,需要在催化剂分离纯化、反应器工程、过程优化与放大等方面进行系统研究,以期满足工业生产的苛刻要求。
Critical Thinking
聚合物的分子量和接枝密度缺乏定量表征。虽然作者通过间接的表征手段(如UV-vis、TGA、FTIR等)证实了聚合物的成功接枝,但对聚合物的分子量、分散度、接枝密度等关键参数缺乏定量数据。这些参数与聚合物的性能密切相关,需要进行更精细的表征。 聚合反应条件的优化还需深入。目前的ATRP反应是在较为温和的条件下进行的,但反应时间较长(3 h)。进一步优化引发剂浓度、反应温度、单体种类等条件,有望在保证生物相容性的前提下缩短反应时间,提高接枝效率。 催化效率与游离酶相比还有差距。尽管文中的光酶、化学酶串联反应展现出优异性能,但与游离的酶催化体系相比,催化效率还有一定差距。这可能与酶在细胞表面的固定化导致构象变化有关,还需要在酶的固定化方式上进一步优化。 实际应用的可行性有待评估。目前的研究仍停留在实验室阶段,离实际应用还有不小的距离。"细胞-聚合物"杂化催化剂能否适应复杂的工业生产环境,如不纯底物、高底物浓度、长期连续反应等,还需要大量的工艺优化和放大研究。 相关机理有待进一步阐明。虽然作者提出了表面聚合物和胞内酶协同催化的假设,但尚缺乏直接的实验证据支持。聚合物的微环境效应如何影响酶催化?表面聚合物和胞内酶在空间上如何实现精准耦合?这些问题还需要深入的机理研究。 长期稳定性的考察还不够充分。文中的循环使用实验只进行了6次,且每次反应时间较短。而工业生产通常需要催化剂长期、连续使用。因此,有必要考察"细胞-聚合物"杂化催化剂在长期使用中的稳定性变化,这对其实际应用至关重要。
Biosyn导师：Changzhu Wu(吴昌柱)
https://www.wugroup.sdu.dk/about-wu/
Changzhu Wu(吴昌柱)是南丹麦大学物理、化学和药学院的副教授。他是丹麦高等研究院(DIAS)的国家精英中心成员,同时也是丹麦化学学会的董事会成员。
作为一名实验化学家,Wu博士致力于探索"酶催化"领域,重点研究酶的固定化和修饰,以实现化学品和药物的绿色合成。他的研究兴趣广泛,涵盖了酶工程、生物催化剂开发、可持续合成等前沿方向。
Wu博士曾获得丹麦自然科学基金会(DFF)的"Sapere Aude领军人才"启动基金(2019年),以及德国研究基金会(DFG)的临时首席研究员资助(2015年)。这些荣誉是对他在酶催化领域做出突出贡献的认可。
Wu博士在德国柏林工业大学获得化学博士学位,并在中国同济大学获得化学硕士学位。丰富的跨国学习和研究经历,让他积累了扎实的化学专业知识和实验技能,也拓宽了他的国际视野。
在南丹麦大学任职期间,Wu博士致力于建设一支高水平的研究团队,开展酶催化及相关领域的前沿研究。他与丹麦乃至欧洲的多个研究机构和工业界建立了广泛的合作,积极推动科研成果的转化和应用。同时,他也非常重视人才培养,悉心指导青年学生和研究人员,帮助他们成长为优秀的科研工作者。
