论文的研究目标和意义
本篇论文的研究目标是提供一个理性的策略，用于使用大肠杆菌重组系统以步骤式方法优化形成通道的膜蛋白的表达、提取和纯化条件。
This protocol provides a rational strategy for optimizing the expression, extraction and purification conditions of channel-forming membrane proteins using the Escherichia coli recombinant system in a step-by- step approach.
形成通道的膜蛋白的重组表达、分离和表征是了解其所嵌入的生物膜的渗透性质的最常用策略之一。表征这些蛋白的挑战在于获得一个具有足够活性以进行重组实验，但又足够纯以显示一致和可重复结果的样品。因此，获得高活性和高纯度的蛋白对于通过重组进行研究非常重要，这对产业发展具有重要意义。
论文提出的新思路、方法和优势
本文提出了一个合理的、步骤式的方法来优化使用大肠杆菌表达系统生产形成通道的膜蛋白。与之前的方法相比，其特点和优势体现在：
使用改良的大肠杆菌菌株BL21Gold(de3)ΔABCF，可以减少膜活性污染物的产生。
采用IPTG诱导系统，保证了在SDS-PAGE中出现清晰条带，便于在提取过程中跟踪目标蛋白。
使用差速离心分离不同可溶性的细菌区室，确定目标蛋白的积累位置。
采用洗涤剂溶液从沉淀中提取目标蛋白，并通过离子交换色谱进一步纯化。
提取过程中优化了表达时间、温度、诱导剂浓度、洗涤剂性质和浓度、孵育时间等参数。
将纯化的外膜蛋白插入外膜囊泡并共同纯化，可在其天然环境中对其进行表征。
本文提供了一个普适性强、合理性高的方法，适用于从大肠杆菌中分离各种形成通道的膜蛋白，并最大程度保证了其活性和纯度。通过本协议可以获得高纯度、高活性的膜蛋白样品用于后续的重组和表征实验。
论文方法部分的重点内容分析
使用改良的大肠杆菌菌株BL21Gold(de3)ΔABCF提高蛋白纯度
作者采用了一种改良的大肠杆菌菌株BL21Gold(de3)ΔABCF来表达目标蛋白,该菌株通过敲除4种主要的外膜蛋白基因(OmpF, OmpC, LamB, OmpA)来减少杂蛋白的污染。
Meuskens and colleagues produced a new strain, called BL21Gold(de3)ΔABCF. In this strain, the ORFs of OmpF, OmpC, LamB and OmpA were genetically removed. Although OmpA does not form large channels, it has an important role in maintaining the bacterial shape and outer membrane stability. Having a ΔOmpA strain is helpful for the production of porin-enriched outer membrane vesicles (OMVs) (Box 3).
使用这种菌株不仅可以保证最终蛋白的电生理纯度,而且IPTG诱导系统可以保证高表达量,从而在SDS-PAGE中得到清晰的目标条带(Figure 2),便于后续的提取和纯化步骤。这突破了膜蛋白纯化过程中杂蛋白污染的瓶颈,提高了最终产物的纯度和均一性。
Figure 2展示了两种外膜蛋白OprO和OprP在不同诱导条件下的表达情况,与OmpE36进行了对比。可以看出,OprO/P在IPTG诱导4小时后有很高的表达量,而OmpE36随着Ara诱导时间的延长表达量逐渐升高。这些结果说明了IPTG诱导系统和Ara诱导系统在不同蛋白中的诱导效果,为优化表达条件提供了参考。
采用差速离心分离不同可溶性细菌组分
为了确定目标蛋白主要富集在哪个细菌组分中,作者采用差速离心的方法,通过不同离心力将细胞裂解液分离成不同组分(Figure 1和Figure 3)。
The cell extract gets centrifuged at different forces to separate the different compartments based on their solubility (Steps 15–18 and Fig. 3). Once it is understood which fraction YPI accumulates in, that pellet must be resuspended with detergent solutions to clear out other membrane-active proteins and then to extract the one of interest.
Figure 1展示了整个分离纯化过程的流程图,中间的SDS-PAGE显示了各组分中蛋白的分布情况。目标蛋白(圈出)在煮沸/未煮沸条件下呈现出典型的"指纹"条带。
Figure 3展示了OprP在不同组分中的分布。可以看出,OprP主要存在于第一次超速离心后的沉淀中(S1)。这种分离策略可以初步判断目标蛋白的富集位置,为后续的提取步骤提供指导,避免了对无关组分的干扰。
优化洗脱条件提取天然构象的活性蛋白
在确定目标蛋白的富集组分后,作者使用了不同洗涤剂溶液对沉淀进行清洗和提取,并优化温度、时间等条件,以获得天然构象的活性蛋白(Figure 4)。
Once YPI is extracted in a supernatant in its native conformation, it is time to separate it from the other membrane active compounds (Steps 20–27). Although in this step it will be hardly biochemically pure, it might be electrophysiologically pure enough for reconstitution into the polarized lipid bilayer.
Figure 4展示了OmpF在不同洗脱条件下的提取效果。0.15% octyl-POE清洗沉淀后,3% octyl-POE可有效从沉淀中提取OmpF。未煮沸样品中可见三聚体构象的条带,表明提取的蛋白保持了天然构象和功能。洗脱条件的优化突破了蛋白变性和失活的技术障碍,为进一步的结构功能研究奠定了基础。
使用阴离子交换色谱进一步提纯目标蛋白
在得到电生理纯度较高的粗提物后,作者采用阴离子交换色谱对样品进行了进一步纯化,以除去残留杂蛋白(Figure 5)。
Figure 5展示了MspA同源蛋白MspARc纯化前后的SDS-PAGE结果。纯化后的蛋白在未煮沸条件下呈现出八聚体条带(分子量约180 kDa),表明色谱纯化有效地除去了杂蛋白,得到了结构完整的目标蛋白复合物。色谱纯化作为一种常规蛋白纯化手段,可显著提高样品的纯度和均一性。
将纯化的外膜蛋白重组到外膜囊泡中
作者创新性地将纯化的外膜蛋白与外膜囊泡(OMVs)共分离纯化,使其重组到囊泡的天然脂环境中。
The fusion of the porins-enriched OMVs into the planar lipid bilayer allows the channels to be characterized in their natural environment.
将蛋白嵌入到与体内环境相似的膜脂中,可以更好地模拟其生理状态,对于研究其结构功能关系和相互作用具有重要意义。这种策略为膜蛋白的体外重组和应用开辟了新的途径。
总结
本文在大肠杆菌表达系统中,通过使用改良菌株、差速离心分离、优化洗脱条件、色谱纯化和OMV重组等一系列方法,成功地分离纯化了几种重要的形成通道的膜蛋白,获得了高纯度、高活性和天然构象的样品。这些发现为深入研究这类蛋白的结构功能关系、与膜脂的相互作用以及在生物技术和药物开发中的应用奠定了重要基础。作者所建立的纯化策略具有较强的普适性和合理性,为膜蛋白的分离纯化提供了新的思路和范例。
研究成果的业界影响和潜在应用
本论文提出的方法为从大肠杆菌高效分离各种形成通道的膜蛋白提供了普适性强、合理性高的策略，将对业界产生以下影响：
为通过重组研究膜蛋白的通道特性提供了高活性、高纯度的样品，有助于深入理解生物膜的渗透性质。
本方法适用于从叶绿体、线粒体或真核生物中分离孔蛋白，并可进一步优化用于分离受体、载体、泵或任何其他膜活性蛋白。
纯化的膜蛋白可用于人工膜的离子电流研究，通过在不同极化和盐浓度下的电流变化，可以推断孔的宽度、离子选择性及结合位点等重要特征。
有助于研究代谢物和抗生素等分子通过细胞膜的机制，为开发新型抗菌药物提供重要信息。
一些非常大的孔蛋白允许核酸和蛋白质通过，在生物技术应用如测序方面具有重要价值。
未来进一步探索的方向和机会
未来在该研究方向上还有以下值得进一步探索的问题和挑战：
进一步优化分离真核生物和人源膜蛋白的条件，扩大方法的适用范围。
探索新型表达系统和纯化方法，进一步提高膜蛋白的产量和纯度。
深入研究纯化的膜蛋白的结构与功能关系，阐明其作用机制。
开发基于特定膜蛋白的新型药物筛选平台和药物递送系统。
发展膜蛋白组装的人工膜体系，用于构建新型生物传感器和仿生器件。
优化膜蛋白纳米孔技术，提高其在生物大分子检测和测序中的性能。
Critical Thinking
实验中只使用了少数几种膜蛋白进行验证，还需要在更多类型的蛋白上进行测试，以证明方法的普适性。
对于不同来源、不同类型的膜蛋白，最优的表达和纯化条件可能存在差异，需要进一步优化。
文中提到该方法可用于分离叶绿体、线粒体或真核生物的孔蛋白，但缺乏相应的实验数据支持。
虽然SDS-PAGE结果显示得到了高纯度的蛋白，但仍需进一步的质谱分析来验证其序列和完整性。
对于纯化后的蛋白，需要进行更多的结构和功能表征，如圆二色光谱、结晶和电生理分析等，以验证其天然构象和活性。
不同批次蛋白制备的重复性和一致性有待进一步验证，以保证实验结果的可靠性。
Biosyn作者：Claudio Piselli https://www.bio.mpg.de/person/131922#:~:text=Startseite.%20Claudio%20Piselli%20(he/him)
Claudio Piselli 是一位有前途的年轻科研工作者。他目前担任博士后研究员，在蛋白质进化部门工作，并隶属于专注分子识别和催化的研究组。Piselli 的研究领域处于生物化学的前沿，可能涉及蛋白质如何随时间演变以及分子层面的识别和催化过程。这些研究对于理解生命的基本过程和开发新的生物技术应用都具有重要意义。
