Science最新| 揭秘疟原虫耐药进化的基因组「指纹」

论文的研究目标和意义

本文于2024年11月28日在线发表于Science。旨在通过系统分析恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum) 的体外进化实验数据,揭示抗疟药物耐药性的关键决定因素。这对于监测药物耐药性并发现新的药物靶点至关重要。

Surveillance of drug resistance and the discovery of novel targets—key objectives in the fight against malaria—rely on identifying resistance-conferring mutations in Plasmodium parasites.

目前监测临床耐药性和发现新耐药等位基因的方法,虽然取得了一定成功,但需要耗时的实验或大量样本。本研究希望通过阐明体外进化实验中共有的耐药决定因素,来增强利用计算方法推断耐药性的能力,加速该领域的研究进展。

>Current approaches, while successful, require laborious experimentation or large sample sizes. To elucidate shared determinants of antimalarial resistance that can empower in silico inference, we examined the genomes of 724 Plasmodium falciparum clones, each selected in vitro for resistance to one of 118 compounds.

抗疟药物耐药性是控制疟疾的一个主要障碍。通过测序对临床分离株进行基因组监测,可以及早发现耐药性标记的出现,为指导特定地区的疟疾治疗提供预警信息。本研究成果有望提高对临床耐药性基因标记的识别效率,加速耐药性监测和药物研发进程,具有重要的产业应用价值。

论文的创新性思路和方法

本研究对724个经118种抗疟化合物筛选获得的耐药克隆进行了全基因组测序和全面分析。与之前的方法相比,本研究有以下特点和优势:

1. 研究规模大,涵盖化合物广泛,可以揭示不同化合物和耐药机制下共有的特征。之前的研究通常局限于少数几个化合物。
2. 采用了体外进化的方法,在相对可控的实验条件下获得耐药克隆。与自然分离株相比,体外获得的耐药突变数量少,更容易识别出真正导致耐药表型的功能突变。

An advantage of in vitro evolution studies is that because relatively few mutations emerge during drug selection, variants with a high probability of conferring resistance can be discovered through careful genome analysis of only a handful of independently derived drug-resistant clones.

1. 系统比较了体外获得的突变与自然分离株中的突变特征差异,凸显了驱动突变的特点:更可能是错义突变或移码突变,更可能发生在保守的、结构有序的蛋白结构域上。

In contrast to naturally occurring variants, those selected in vitro are more likely to be missense or frameshift, involve bulky substitutions, and occur in conserved, ordered protein domains.

1. 研究还关注了拷贝数变异 (CNVs) 在耐药性方面的重要作用,许多CNVs涉及药物作用靶点或外排泵的扩增。通过分析CNV的边界区域,揭示了微同源介导修复可能是扩增的主要机制。
2. 通过对反复出现突变的基因进行网络分析,揭示了多个AP2转录因子可能参与耐药性和实验室适应性进化。这为进一步研究Plasmodium应激适应的转录调控机制提供了线索。

恶性疟原虫获得抗疟药耐药性的关键基因组特征

1. 体外进化获得的突变与自然分离株突变特征存在显著差异

本研究对724个经118种抗疟化合物筛选获得的耐药克隆进行了全基因组测序分析。通过与自然分离株的突变谱进行比较,发现两者在突变类型、碱基转换模式、氨基酸替换性质以及在蛋白结构域上的分布等方面存在显著差异(图1)。

In contrast to naturally occurring variants, those selected in vitro are more likely to be missense or frameshift, involve bulky substitutions, and occur in conserved, ordered protein domains. (Fig. 1)

图1. 恶性疟原虫体外进化获得的突变与自然分离株突变的特征比较

这些结果突破了以往对疟原虫突变特征认识的局限,揭示了在药物选择压力下,驱动耐药性进化的突变具有独特的基因组特征。这为后续开发基于基因组变异预测耐药性的工具奠定了重要基础。

2. 拷贝数变异在耐药性进化中扮演关键角色

通过对基因组序列的深入分析,研究鉴定出多个涉及药物作用靶点和外排泵基因扩增的拷贝数变异(图2),突出了CNV在疟原虫获得耐药表型过程中的重要作用。

>Copy number variants (CNVs) have been shown to mediate clinically relevant drug resistance phenotypes in malaria parasites. ... CNV analysis revealed that 271 of the 724 clones harbored at least one of 420 CNVs with P < 0.0001. These CNVs included amplifications of known targets, such as pfpi4k, pfproRS, and the acetyl–coenzyme A transporter (pfat1), as well as multidrug resistance genes (pfabci3, pfmdr1) (Fig. 2A).

图2. 拷贝数变异频繁驱动疟原虫对抗疟药物的耐药性

此外,通过分析CNVs的边界区特征,研究发现它们多以串联重复形式出现,断点集中在基因间区和AT含量高的重复序列丰富区域(图2C、D),提示微同源介导的修复机制可能参与其形成。这为深入研究CNV的产生机制提供了新的思路。

3. 多个新的基因-药物关联关系被发现

通过分析在不同化合物筛选中反复出现突变的基因,研究发现了一系列已知和新的耐药相关基因(图3)。其中不仅包括已知的多药耐药基因如pfmdr1、pfcrt和pfcarl等,还发现了一些新的关联,如:

• PF3D7_1008700(编码微管蛋白β链)的突变与抗真菌大环内酯类化合物desoxyepothilone B的耐药性相关;
• PF3D7_0915000(编码NADH脱氢酶NDH2)的突变可能通过影响辅因子结合,介导对铜离子螯合剂GNF-Pf-5611的耐药性;
• PF3D7_0609100 (锌转运蛋白pfzip1)突变导致对喹啉-4-羧酰胺类化合物MMV008434耐药。

这些发现为深入研究相关化合物的作用机制和开发新的药物靶点提供了重要线索。

4. AP2转录因子在耐药性和培养适应性进化中可能扮演关键角色

网络分析揭示,AP2转录因子基因pfap2-g和几个染色体上的AP2转录因子在经不同化合物筛选获得的耐药克隆中频繁突变(图3B、C),提示它们可能参与了耐药性获得和培养条件适应的进化过程。

>Several large, conserved proteins were overrepresented, including PF3D7_0619300, PF3D7_1464500, and PF3D7_0510100, each mutated three times independently. Many of the highly overrepresented genes (7 of 14 genes mutated at least eight times independently), particularly drug targets, were also contained within CNVs. To identify genes likely to be involved in multidrug resistance, we plotted the likelihood of enrichment by chance against the number of associated compounds (Fig. 3B and fig. S4). These data showed that genes such as pfmdr1 and pfap2-g were mutated in selections with a wide variety of compounds.

这一发现突破了以往对疟原虫转录调控在耐药性中作用的认识,为深入研究其分子机制提供了新的视角和切入点。

5. 验证了特定PfMDR1和PfCARL突变对药物敏感性的影响

为了评估体外筛选获得的突变与自然分离株突变在表型上的差异,研究比较了携带这两类pfmdr1和pfcarl突变的疟原虫对相关化合物的敏感性(图4)。

To compare the effect of missense mutations arising from compound selections to that of naturally occurring polymorphisms, we tested the sensitivity of different PfMDR1, PfCARL, and PfATP4 mutant parasites to panels of compounds.

结果证实,对特定化合物筛选获得的PfMDR1和PfCARL突变体,普遍比自然存在的突变体对相应化合物的敏感性降低更多。同时,这些突变多位于蛋白质的跨膜结构域,靠近预测的药物结合位点,而自然突变则分布较为分散。

图4. 比较携带体外筛选获得突变和自然突变的疟原虫对pfcarl、pfmdr1和pfatp4相关化合物的敏感性

这些实验数据有力地支持了体外进化研究能够富集到真正具有功能影响的耐药突变,突变的结构位置是区分驱动突变和乘客突变的关键特征。

核心发现小结

通过对大规模体外进化实验数据的系统分析,本研究发现:

1. 在抗疟药物选择压力下获得的突变,在多个基因组特征上与自然分离株的突变存在显著差异;
2. 拷贝数变异通过扩增药物作用靶点和外排泵基因,在耐药表型获得中扮演关键角色;
3. 发现了多个新的化合物-基因关联关系,为药物作用机制和新靶点研究提供了线索;
4. AP2转录因子在耐药性和环境适应性进化中可能发挥重要的调控作用;
5. 实验验证了部分PfMDR1和PfCARL突变对相关药物敏感性的影响,突变的结构位置是区分驱动突变的关键特征。

研究成果的影响与潜在应用

本研究的突变数据集为开发能从临床分离株中识别耐药相关基因组变化的算法提供了重要的训练素材。同时也为前向遗传学研究区分功能性突变和非功能性突变提供了参考。

该数据显示,在当前抗疟药物研发管线中,约一半的候选化合物容易产生耐药性(图3A)。因此在研发过程中,应优先选择耐药风险低的化合物,并寻找"交叉敏感通路" (collateral sensitivity pathways) 来指导联合用药方案的制定。

>The impressive breadth of resistance mechanisms across our dataset indicates that P. falciparum evolves resistance with relative ease. Indeed, half the compounds in our dataset, which encompasses much of the chemical space in the current portfolio of next-generation antimalarials, appear vulnerable to resistance acquisition. Drug development strategies should therefore minimize this liability by prioritizing resistance-refractory compounds and by identifying collateral sensitivity pathways, in which resistance to one antimalarial increases sensitivity to another, to inform combination therapies.

另一方面,本研究发现一些新的基因-化合物关联关系,如PF3D7_1008700 (编码微管蛋白β链)与desoxyepothilone B的关联,pfndh2与GNF-Pf-5611的关联,pfzip1与MMV008434的关联等,为深入研究这些化合物的作用机制和开发新的药物靶点提供了线索。

未来研究方向与挑战

虽然本研究的突变集具有多样性,但某些药物和靶点可能存在过度代表的问题。未来构建预测模型时,需要注意避免化合物特异性偏差。同时,获得的突变不太可能覆盖某种菌株和化合物组合下所有可能的耐药机制,需要进一步的实验如连续定向进化、最小耐药接种(MIR)等来全面刻画耐药性产生的过程。

此外,体外进化模型难以完全模拟体内感染过程中宿主免疫等因素的选择压力。实验室菌株经过长期传代培养,可能已经积累了多种适应性突变,其遗传背景可能与当前自然分离株不完全一致。尽管如此,受控实验条件下获得的突变数据对指导药物研发和临床应用仍然具有重要价值。

未来研究可进一步探索以下问题:

1. 如何整合本研究突变数据与已有的临床分离株测序数据,开发出高效准确的耐药突变预测工具?
2. AP2转录因子在疟原虫应激适应中扮演什么角色?其转录调控网络如何响应药物压力?
3. 新发现的化合物-基因关联如pfzip1-MMV008434的分子作用机制是什么?这些信息能否指导开发新的药物?
4. 能否利用CRISPR等基因编辑技术在自然分离株遗传背景下验证这些突变的耐药表型?

Critical Thinking

1. 尽管本研究的突变数据集具有广泛性,但某些化合物和药物靶点可能存在过度代表的问题。未来构建预测模型时需要注意避免这种偏差。
2. 由于体外进化实验中每个化合物通常只获得少数几个耐药克隆,很可能无法捕捉到所有可能的耐药机制。需要更多的实验数据来全面刻画特定菌株和化合物组合下耐药性的产生过程。
3. 体外进化模型难以完全重现体内感染过程中的选择压力,如宿主免疫系统和宿主-寄生虫相互作用等因素的影响。而且使用的实验室菌株经过长期培养,其遗传背景可能与自然分离株有差异。尽管如此,受控条件下获得的突变数据对药物研发仍有重要参考价值。
4. 通过比较突变频率,本研究推断某些变异更可能导致耐药表型。但频率并不能完全等同于功能影响。一些关键的低频突变可能被忽略,而一些高频突变实际可能是固定的适应性突变。后续还需要更多的实验验证。
5. 对CNVs机制的研究还不够深入,断点区域的序列特征分析比较初步,有待后续研究来阐明不同区域发生CNV的机制差异。
6. 本研究主要关注SNV、indel和CNV,对于结构变异等其他类型的基因组改变关注不够。一些低频或平衡的结构变异可能被漏检。拓展变异检测方法有助于更全面地认识耐药相关的基因组改变。

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Biosyn导师：Elizabeth A. Winzeler

https://en.wikipedia.org/wiki/Elizabeth_A._Winzeler

Elizabeth Ann Winzeler 是一位美国微生物学家和遗传学家。她目前是加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院宿主-微生物系统与治疗学部的教授。虽然她在多个不同的疾病领域工作,但大部分研究都集中在开发更好的疟疾治疗和根除药物上。

Winzeler教授于1962年5月8日出生于俄亥俄州的Canton市,在内华达州的里诺长大。她在俄勒冈州波特兰的Lewis and Clark College获得了自然科学和艺术学士学位。大学毕业后,她先是做了4年专业的程序员和系统分析师,然后在俄勒冈州立大学获得了生物物理学和生物化学硕士学位,1996年在斯坦福大学获得发育生物学博士学位。博士后她留在斯坦福,师从Ronald W. Davis,在酿酒酵母的后基因组分析方法开发中发挥了重要作用。

1999年,Winzeler被Peter G. Schultz招募到新成立的诺华研究基金会基因组学研究所工作。2000年,她在斯克里普斯研究所细胞生物学系获得助理教授的第二职位。2012年,她转到加州大学圣地亚哥分校,目前是儿科系教授,兼任 UCSD健康科学免疫、感染和炎症中心的转化研究主任。