论文的研究目标及其意义
这篇发表在《Science》上的研究论文旨在阐明厌氧微生物中最古老的二氧化碳固定途径—— 伍德-隆达尔(Wood-Ljungdahl)代谢途径的分子机制。论文聚焦于该途径的关键酶—— 一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶复合物(CODH/ACS),通过解析其结构,刻画了整个催化过程的分子动态变化。
In this work, we aimed to capture the CODH/ ACS in action by visualizing the missing conformations in various protein-protein interaction or ligand-bound states.
伍德-隆达尔(WL)途径广泛存在于产乙酸菌和产甲烷古菌中,在厌氧条件下将CO2转化为乙酰辅酶A。这是自然界中最古老、最高效(就ATP消耗而言)的CO2固定途径。深入理解WL途径的分子机理,对于开发高效的CO2转化和固定技术、改善合成气发酵等生物技术工艺具有重要意义。
The most ancient pathway for carbon dioxide (CO2) fixation, the Wood-Ljungdahl pathway, also known as the reductive acetyl–coenzyme A (acetyl-CoA) pathway, is also the most efficient natural CO2 fixation pathway in terms of adenosine triphosphate (ATP) input (1, 2). This strictly anaerobic process, performed by a wide range of acetogenic bacteria and methanogenic archaea (3), is also used in biotechnology (4–6).
研究方法和创新性
本研究采用了一系列结构生物学方法,尤其是**冷冻电镜(cryo-EM)**技术,系统解析了CODH/ACS复合物在与多个辅助因子相互作用及底物结合过程中的构象变化:
通过对CO处理的CODH/ACS-铁氧还蛋白复合物和碘甲烷处理的辅因子铁硫蛋白(CoFeSP)进行冷冻电镜分析,捕捉了电子传递、一氧化碳固定、甲基转移等多个反应中间态的高分辨率结构。 通过对ACS结构域的聚焦分类和局部精修,揭示了ACS在催化过程中的多个构象状态(闭合、超伸展、半伸展等),并提出了基于结构域间距的分类方案。 结合X射线晶体学获得了CODH/ACS与反应产物乙酰辅酶A结合状态的晶体结构。 采用量子力学/分子力学(QM/MM)计算对关键金属簇的化学性质进行了理论分析。
综合这些结构信息,本研究提出了一个基于ACS构象变化的CODH/ACS催化反应分子模型。相比过去的研究,本文的创新性主要体现在:
在接近生理条件下,捕捉到了更多过渡态和中间态的高分辨率结构 系统表征了ACS结构域在催化过程中的构象变化谱,并提出了新的构象命名方案 阐明了辅助蛋白和辅因子与CODH/ACS的结合模式及诱导的构象变化 在分子水平上对CODH/ACS催化CO2还原生成乙酰辅酶A的完整过程给出了结构解释
通过冷冻电镜揭示了铁氧还蛋白与CODH/ACS的结合模式及电子传递机制
作者利用冷冻电镜技术,解析了铁氧还蛋白(ferredoxin)与CODH/ACS复合物的结构(分辨率1.94Å),发现铁氧还蛋白不对称地结合在CODH二聚体的C2对称轴上,并且距离CODH的D簇[4Fe-4S]足够近,支持电子传递。
Hydrogen bonding and hydrophobic contacts stabilize the complex (fig. S6B), forming an interaction network that could be supplemented by electrostatic attraction between positively charged residues (Lys 35 , Lys 63 ) on the flexible loops of the CODH and the negatively charged area of the ferredoxin (fig. S6C). A previous study questioned the role of the D-cluster as an electron entry or exit point owing to its midpoint potential in the monofunctional CODH of Rhodospirillum rubrum (25, 36). However, the observed interaction and the intercluster distance of 8.7 Å in our structure supports ferredoxin docking and electron transfer at the D-cluster (Fig. 1A) (7, 12, 26–28, 37). Electrons are then transferred via the B-cluster to the catalytic C-cluster.
Figure 1. 展示了铁氧还蛋白与CODH/ACS复合物的结合模式,以及D簇与铁氧还蛋白 [4Fe-4S]簇之间的距离(8.7Å)。这一结果为铁氧还蛋白向CODH/ACS供电子提供了直接的结构证据,有助于理解厌氧CODH如何获得还原力进行CO2还原。之前的研究质疑D簇作为电子入口/出口的作用,本研究则驳斥了这一观点。
此外,作者还对CODH活性中心C簇的结构进行了精修。QM/MM计算支持C簇中Ni和Fe之间存在成键相互作用,Ni-Fe平均键长为2.5Å。
QM/MM calculations using density functional theory (DFT) for the quantum region (supplementary text, figs. S8 and S9, and table S3) support this hypothesis, yielding an average Ni-Fe u distance of 2.5 Å, which we have modeled accordingly in the C-cluster (fig. S7A).
这一发现揭示了C簇中Ni-Fe键可能在CO2还原过程中作为电子储存库的新功能。
系统解析了ACS在催化过程中的多个构象状态
通过对ACS结构域进行聚焦分类和局部精修,作者解析了ACS在与CoFeSP相互作用和底物结合过程中的一系列构象状态,主要包括闭合(closed)、超伸展(hyperextended)、半伸展(semi-extended)和产物结合(product-bound)状态。这些状态通过ACS结构域之间的距离(L1-3和L2-3)进行描述。
By focusing classifications and refinement of symmetry-expanded datasets (fig. S10), we were able to separate two classes (named class 1 and 2 in the processing workflow, refined to resolutions of 2.83 and 3.29 Å, respectively) with clear density for A2 and A3 but without additional density attributed to CoFeSP (figs. S4, C and D, S10, and S11; and tables S2 and S4).
Focused classification of the flexible ACS unveiled a third class corresponding to the CODH/ACS-CoFeSP complex (Fig. 1, B and D; figs. S10, S11, and S15; and tables S2 and S4).
在闭合状态下,A簇可接近Ni上的CO,为羰基化反应创造条件;
In the closed state, the A-cluster apposes the A1 surface. A predicted CO channel emanating from the C-cluster opens into a solvent-occluded space around the A-cluster (29). In this state, an additional density observed on Ni p is modeled as a CO bound to the tetrahedral Ni (fig. S14, A and B).
在超伸展状态下,ACS与CoFeSP结合,A簇暴露在溶剂中,为甲基转移反应创造条件。
Compared with the extended state obtained by crystallography (PDB ID 6YTT, chain A) (16), ACS complexed with CoFeSP maintains a long L 1-3 and additionally opens L 2-3 by means of a 59° rotation of A3, leading to a hyperextended state (figs. S13C and S16 and table S6). Consequently, this is the sole state obtained in our study in which the A-cluster is fully accessible for methyl transfer.
Figure 4A. 总结了本研究捕捉到的ACS在催化过程中的主要构象状态,并用L1-3和L2-3两个指标(分别代表A1-A3和A2-A3之间的距离)对其进行分类。不同的构象状态对应着ACS在催化过程中的不同功能。
这些构象状态的发现有助于理解ACS在催化过程中的构象动力学,是对CODH/ACS结构生物学的重要补充。特别是超伸展状态的发现,为CoFeSP与ACS的对接及甲基转移提供了结构基础。
阐明了CoFeSP与ACS的结合机制及诱导的构象变化
作者解析了CODH/ACS与CoFeSP复合物的高分辨率结构,发现CoFeSP在三个位点与ACS发生相互作用:CoFeSP小亚基与A1和A3接触;CoFeSP大亚基的[4Fe-4S]结构域与A3相互作用;CoFeSP大亚基的B12结合结构域也与A3接触。
通过3D变异性分析,作者进一步观察到CoFeSP与ACS结合后,B12结构域发生旋转运动(约47°),使B12逐渐接近A簇上的Nip原子(最近距离6.7Å),为甲基转移创造了有利条件。同时,B12与CoFeSP间的氢键断裂,形成了新的B12与ACS间的相互作用。
In the 3A-3B-3Cb sequential movement, the B12 ring progressively breaks all hydrogen bonds with the CoFeSP and establishes new ones with the ACS, including with cluster-ligating cysteine residues of the A-cluster (Fig. 2C). This rotation also reduces the solvent exposure of the A-cluster [4Fe-4S] cubane. The conserved hydrogen bond–forming residues stabilize the B12 as it moves toward the A-cluster, with the shortest Co-Ni p distance of 6.7 Å observed in 3Cb (Fig. 2, B to D)
Figure 2. 解析了CoFeSP B12结构域在与ACS结合后的旋转运动,使B12逐渐靠近A簇,为甲基转移提供结构基础。
相关残基的保守性分析表明,ACS与CoFeSP间的相互作用在细菌和古菌中是保守的。这提示它们之间的结合模式可能在不同物种中是相似的。
这些发现阐明了CoFeSP与CODH/ACS的结合机制,揭示了B12结构域的动态变化如何介导甲基向ACS的转移,是对WL途径甲基分支的重要补充。
捕捉到CODH/ACS与反应产物乙酰辅酶A的结合状态
尽管通过冷冻电镜未能捕捉到CODH/ACS与CoA或乙酰CoA的复合物,但作者通过X射线晶体学获得了CODH/ACS与乙酰CoA共结晶的结构(分辨率2.93Å)。
By cocrystallizing CaCODH/ACS with acetyl-CoA, we obtained a 2.93-Å x-ray structure of the product-bound complex (CODH/ACS AC ; Fig. 1F and table S8). The global conformations resemble those of the as-isolated CaCODH/ ACS (16) (fig. S25). However, the previously semiextended ACS now exhibits additional density spanning the A2 surface and reaching A3, modeled as acetyl-CoA, whereas the extended ACS of the other asymmetric unit lacks such density, reflecting the requirement for a specific conformation to allow ligand binding (Fig. 3, A and B, and figs. S26 and S27).
Figure 3. 展示了乙酰CoA在CODH/ACS上的结合位点及关键相互作用。乙酰CoA主要与A2结构域结合,同时诱导A3发生旋转,使A簇更加靠近乙酰CoA。保守的Arg383和His386残基可能在催化乙酰基转移中发挥关键作用。
这一结构揭示了乙酰辅酶A合成的最后一步反应——乙酰基从A簇转移到CoA上的分子机制,特别是凸显了 A3结构域运动在促进乙酰基转移中的重要性。同时也为理性设计和改造CODH/ACS,发展新型乙酰CoA合成酶奠定了结构基础。
总结
作者运用X射线晶体学、冷冻电镜、聚焦分类与三维重构等技术,系统解析了厌氧CODH/ACS催化CO2还原过程中的一系列关键结构。主要成果包括:
1)发现铁氧还蛋白与CODH复合物的结合模式,阐明了厌氧CODH获得还原力的机制;
2)捕捉到ACS在催化过程中的多个重要构象状态,揭示了ACS结构域的动态变化如何驱动羰基化和甲基化等反应;
3)阐明了CoFeSP与ACS的结合方式及诱导的B12结构域旋转运动,为甲基转移提供了分子机制;
4)获得了CODH/ACS与反应产物乙酰CoA复合物的结构,揭示了乙酰基转移到CoA的关键步骤。
研究成果的影响和应用前景
本研究解析了WL途径关键酶CODH/ACS催化CO2还原的分子机制,为深入理解厌氧微生物的固碳代谢提供了新的结构视角,将推动相关领域的发展。主要体现在:
从分子水平阐明CODH/ACS的催化机制,有助于指导相关酶的定向改造,发展高效的CO2转化与利用技术 为优化合成气发酵、微生物电合成等生物技术过程提供新的思路 加深对厌氧CO2固定和C1代谢的认识,为探索地球早期生命的起源和演化提供线索 为开发新型固碳生物系统、构建人工光合作用体系提供重要的分子基础
未来研究方向与挑战
尽管本研究在揭示WL途径的分子机制方面取得了重要进展,但仍有许多问题有待进一步探索:
解析更多CODH/ACS催化过程中的中间态结构,如甲基结合态、CO和甲基双结合态、乙酰基结合态和CoA结合态等,以完善催化循环的结构景观 研究ACS结构域的大尺度构象变化是如何被触发和调控的,以及这些变化与A簇上的原子级重排之间的关系 深入研究WL途径中的其他关键酶,如甲酸脱氢酶、甲基转移酶等,阐明它们的分子机制及其与CODH/ACS的协同作用 探索CODH/ACS催化机制的普适性,比较不同物种(如产乙酸菌和产甲烷菌)中该酶的异同 在动态和生理条件下原位解析CODH/ACS的结构与功能,研究酶学和结构生物学数据与细胞内实际催化过程的关联
Biosyn导师：Bonnie J. Murphy
https://www.biophys.mpg.de/2658749/bonnie-murphy
Dr. Bonnie Murphy是是马普学会生物物理研究所(Max Planck Institute of Biophysics)的马普研究组组长。在此之前,Bonnie于2016-2019年在该研究所结构生物学系担任博士后研究助理,2014年在牛津大学从事博士后研究。2013年,她获得了牛津大学化学专业的博士学位,而在2008年本科毕业于圣弗朗西斯泽维尔大学,获得生物学和化学的双学位。
Bonnie在学术界取得了一系列耀眼的成就。2023年,她荣获了德国联邦教育和研究部颁发的 Heinz Maier-Leibnitz奖,这是德国授予青年研究人员的最高奖项之一。同年,她还入选了欧洲分子生物学组织(EMBO)青年研究员计划(2023-2026)。2019年,她获得了欧莱雅-联合国教科文组织"女性科学家奖"。在牛津大学博士期间(2008-2012),她获得了著名的Clarendon博士后奖学金。
除了从事cutting-edge的科研工作,Bonnie还先后主持和参与了多个研究项目。她目前是德国科学基金会资助的跨学科研究中心CRC-1507的项目负责人,该中心旨在研究与膜相关的蛋白质组装、机器和超级复合物。这凸显了她在膜蛋白结构与功能领域的学术影响力。
