论文的研究目标和意义
本研究于2024年12月20日在线发表于Science。目标是揭示 GLYCOALKALOID METABOLISM15 (GAME15) 蛋白在茄科植物中的重要作用。GAME15 是一种纤维素合成酶样蛋白 (CSL),在甾体糖苷生物碱 (SGAs) 的生物合成中扮演关键角色。SGAs 是一类重要的植物次生代谢物,作为抗营养因子,对人类健康有潜在危害,但对植物自身具有防御作用。如论文所述:
SGAs, for example, are renowned antinutritional factors for humans while being potent defense agents for plants and simultaneously self-toxic at a certain threshold.
研究发现,GAME15 既是一种活性的葡糖醛酸转移酶,能催化 SGA 前体胆固醇的葡糖醛酸化修饰;同时还是一种支架蛋白,通过蛋白-蛋白相互作用形成多酶复合物,调控 SGA 生物合成。这一发现揭示了植物如何平衡防御代谢与自身毒性,对于设计生产高效、低毒次生代谢物的工程化植物具有重要意义。
论文的主要思路、方法和特点
论文通过多组学分析,发现 GAME15 基因与其他 SGA 合成基因形成基因簇,提示其参与 SGA 代谢。 体外实验证实,GAME15 具有将葡糖醛酸基团转移到胆固醇上的葡糖醛酸转移酶 活性,生成胆固醇葡糖醛酸苷 (CHR-GlcA)。 在烟草和酵母中异源表达 GAME15 及其他 SGA 合成酶,揭示了 GAME15 介导的胆固醇葡糖醛酸化修饰对于后续羟化反应和 SGA 生成的重要性。如图3所示:
图3. GAME15 是异源系统中 SGA 生物合成工程的关键
通过RNA干扰 (RNAi) 和CRISPR-Cas9 敲除 GAME15 基因,发现 SGA 水平显著降低,胆固醇大量积累。质谱成像进一步揭示了 GAME15 介导的代谢物变化在水果和块茎组织中的空间分布(图4)。 利用荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 和荧光共振能量转移 (FRET) 等技术,发现 GAME15 与其他 SGA 合成酶形成多酶复合物。液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 分析进一步揭示了 GAME15 参与形成的代谢区室 结构能促进代谢物的高效底物传递 (图5)。
GAME15 also enables engineering SGAs in N. benthamiana by forming a protein complex with other SGA biosynthetic enzymes and facilitates the efficient conversion of cholesterol to SGAs by mediating metabolite channeling.
总之,本研究从基因、蛋白、代谢和细胞多个层面,系统揭示了 GAME15 作为葡糖醛酸转移酶和支架蛋白在 SGA 生物合成中的重要作用。这为工程改造植物次生代谢途径提供了新思路。
植物次生代谢中支架蛋白与代谢区室的重要作用
本研究通过一系列实验,系统揭示了茄科植物中 GAME15 蛋白在甾体糖苷生物碱 (SGAs) 生物合成中的核心功能。获得了以下几个关键发现:
GAME15 是一种活性的胆固醇葡糖醛酸转移酶
作者首先在烟草叶片中瞬时表达 GAME15,利用液相色谱-质谱联用技术检测到其催化产物胆固醇葡糖醛酸苷 (CHR-GlcA) 的生成(图2A)。
Analysis of methanolic extracts of infiltrated samples showed that in the presence of GAME15, endogenous cholesterol was converted to cholesterol glucuronide (CHR-GlcA) [mass/charge ratio (m/z) = 561.379; Fig. 2A and fig. S4].
进一步实验表明,只有在 GAME15 存在的情况下,下游的细胞色素 P450 酶 GAME6 和 GAME8 才能催化 CHR-GlcA 的羟化反应(图2B-D)。这些结果证实了 GAME15 是一种新型的葡糖醛酸转移酶,在 SGA 生物合成中起关键作用。
为进一步验证该酶活性,作者在胆固醇产生型酵母中共表达 GAME15 和 UDP-葡萄糖脱氢酶 UGD1,成功检测到 CHR-GlcA 的生成(图2G)。同位素示踪实验进一步证实了这一转化过程(图2H)。这表明 GAME15 在异源系统中也能发挥催化活性,为 SGA 的代谢工程奠定了基础。
GAME15 的缺失导致 SGA 合成受阻和胆固醇积累
为探究 GAME15 在体内的功能,作者利用 RNA 干扰和 CRISPR-Cas9 技术分别在番茄和马铃薯中敲低或敲除 GAME15 基因。结果发现,SGA 含量显著降低(图4A、K、L),而游离胆固醇大量积累(图4B、M)。
Metabolite analysis of the RNAi tomato leaves showed a notable reduction in SGA content, with α-tomatine levels reduced on average by 35-fold as compared with wild type (WT) (Fig. 4A). We observed the same phenomenon in potato RNAi lines in which GAME15 silencing resulted in a marked reduction in α-solanine and α-chaconine accumulation (Fig. 4, K and L). On the other hand, LC-MS and gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) analysis of sterols showed high accumulation of cholesterol and cholesteryl glucoside in the GAME15i tomato and potato lines (Fig. 4, B, C, M, and N, and fig. S11).
空间代谢物成像进一步揭示,番茄果皮和马铃薯块茎外层是 SGA 合成和胆固醇积累的主要部位(图4E、J)。这些结果有力地证明了 GAME15 介导的胆固醇葡糖醛酸化修饰对于 SGA 合成和胆固醇稳态维持的重要性。
GAME15 参与组装多酶复合物以高效催化 SGA 生成
前述实验表明,GAME15 催化的胆固醇修饰对于 SGA 生物合成至关重要。作者推测其可能参与组装多酶复合物,形成高效的反应区室。为验证这一假说,作者采用多种蛋白互作分析技术对 GAME15 与其他 SGA 合成酶的相互作用进行了系统研究。
荧光寿命成像-荧光共振能量转移(FLIM-FRET)实验显示,GAME15 与 GAME6、GAME8 以及胆固醇合成酶 C5-SD2、7-DR2 存在明显的相互作用(图5A),提示其共同组装成多酶复合物。
免疫共沉淀-质谱分析进一步证实了这些蛋白之间的互作(图5B、C)。有趣的是,在 GAME15 参与的复合物中还鉴定到一些具有辅助折叠、跨膜转运等功能的组分,暗示其可能参与代谢物的高效转运和区室化。
为了证明这种多酶组装对代谢效率的影响,作者进行了同位素示踪实验。结果表明,与单独表达对照组相比,共表达 GAME15 等酶的烟草叶片中,标记的胆固醇向 SGA 代谢产物的转化效率显著提高(图5E、F),提示酶复合物的形成增强了代谢流量。
>Our results showed relatively low label incorporation with the GAME enzymes, as merely 0.5% of the detected tomatidenol originated from labeled cholesterol, whereas in the case of the Liriope enzymes, the incorporation of the labeled intermediate was about 20 times as high (P = 6.218 × 10−11) (Fig. 5E). This notable difference suggests metabolite channeling.
这些结果支持 GAME15 作为支架蛋白将相关酶组装成代谢区室,实现底物的高效传递和 SGA 的定向合成。这一发现为植物次生代谢途径的精细调控和合成生物学改造提供了新思路。
敲除 GAME15 削弱马铃薯的昆虫抗性
前面的结果表明,GAME15 突变体中 SGA 含量显著降低。考虑到 SGA 是茄科植物重要的化学防御物质,作者推测 GAME15 缺失可能会影响植物抗虫性。为验证这一设想,他们比较了野生型和 GAME15 突变马铃薯对棉铃虫的抗性差异。
结果发现,昆虫取食突变体植株的叶片面积显著高于野生型(图6B、C),提示 SGA 的减少削弱了植物的抗虫能力。生长实验进一步表明,取食突变体叶片的昆虫体重显著高于取食野生型的个体(图6D)。
S. littoralis (Egyptian cotton leafworm) growth and feeding experiment was done as described previously (54).
这些结果证实了 GAME15 参与的 SGA 代谢在植物防御中的重要生态作用,为茄科作物育种提供了新的思路和靶点。
对 GAME15 进化的新认识
通过系统发育分析,作者发现茄科植物中的 GAME15 与其他物种中催化糖基转移的纤维素合成酶样蛋白(CSL)同源(图1B),提示其可能起源于初级代谢。但与参与细胞壁合成的 CSL 蛋白不同,GAME15 特异定位于内质网,并获得了独特的催化和支架功能,使其能够灵活地连接初级和次生代谢过程。
Phylogenetic analysis revealed that GAME15 CslM-type proteins from both tomato and potato are related to SOAP5 and similar proteins attaching GlcA to the triterpenoid saponins backbone (28, 29). However, the evolved GAME15 substrate specificity is restricted exclusively to a set of steroidal metabolites.
...
The enhanced specificity of GAME15 in planta further stems from the formation of a metabolon that involves enzymes from both the cholesterol and SGA biosynthetic pathways.
这一结果为植物代谢多样性的进化机制提供了新的见解,即初级代谢酶向次生代谢的功能转化和空间重定位可能是次生代谢物多样性形成的重要驱动力。作者总结了 GAME15 参与构建 SGA 生物合成代谢区室的分子机制和进化过程(图3A)。这一模型很好地诠释了代谢进化如何在赋予植物新的生态功能的同时,又巧妙地平衡次生代谢的有益性和自毒性。
小结
本研究发现 GAME15 是一个集葡糖醛酸转移酶和支架蛋白于一身的关键酶,在茄科植物 SGA 生物合成中扮演核心角色。它通过催化 SGA 前体胆固醇的葡糖醛酸化修饰,并与其他酶组装成多酶复合物,形成高效的底物传递通道,实现 SGA 生物合成的精细调控。GAME15 的发现不仅填补了人们对 SGA 代谢分子机制认识的空白,也为植物次生代谢工程提供了新的思路和工具。同时,作为植物防御的关键因子,GAME15 在茄科作物抗虫育种方面也具有重要应用前景。此外,作者还从进化角度阐释了 GAME15 的起源和功能创新,为探索植物次生代谢多样性的分子基础提供了很好的范例。相信随着代谢生物学和合成生物学的不断发展,人们对植物代谢调控网络的认识将不断深入,植物次生代谢物的定向改造和异源合成也将取得更大突破。
研究成果的应用前景
GAME15 的发现为植物 SGA 代谢工程提供了新的思路和方法:
目前 SGA 在异源系统中的生产效率较低,GAME15 催化的胆固醇葡糖醛酸化修饰被证实是限速步骤。因此,GAME15 可作为代谢工程的关键酶靶点,提高 SGA 的异源合成水平。 SGA 虽然具有重要的药用价值,但同时也是抗营养因子。GAME15 参与的代谢区室结构可作为灵感,设计高效、低毒的生物合成途径,平衡 SGA 的积累与毒性。 在 GAME15 参与形成的多酶复合物中,还鉴定到一些具有助力蛋白高效折叠、跨膜转运等功能的组分。它们有望与代谢酶协同工作,进一步提高代谢效率。未来可深入探索 GAME15 相互作用的调控网络。 在马铃薯中敲除 GAME15 导致块茎中的 SGA 几乎完全消失(图4K、L),这为培育低毒、适口性更好的马铃薯品种提供了新思路。但同时需要考虑 SGA 降低可能带来的抗虫抗病能力下降等负面影响。
未来的研究方向和商业机会
本研究在 SGA 代谢工程和植物防御机制方面取得了重要突破,但仍存在一些有待进一步探索的科学问题:
GAME15 催化的 CHR-GlcA 中间产物如何在细胞内转运?负责水解葡糖醛酸基团的酶是什么?它在整个代谢过程中起到什么调控作用?阐明 SGA 代谢过程中底物和中间产物的时空动态变化,将有助于理解代谢流的精细调控机制。 SGA 防御代谢如何与其他初级、次生代谢途径相互交叉调控?GAME15 是否参与其中的信号转导过程?这可能催生植物代谢和信号网络整合研究的新方向。 GAME15 突变导致植物体内游离胆固醇大量积累,但尚不清楚这种积累如何影响植物的生长发育。这一发现有望引发人们对胆固醇代谢及其调控机制的新兴趣。 利用代谢区室策略实现 SGA 高效异源合成,有望大幅降低 SGA 的生产成本,为其作为药物中间体或农药先导化合物的开发应用带来商业价值。如何在工业化生产中最大限度地模拟这种天然的多酶复合物结构和功能,将成为代谢工程领域的一个新挑战。 GAME15 基因的发现也为运用基因编辑技术定向改良茄科作物品质(如低毒马铃薯)带来了可能。但可食用植物的基因编辑在监管政策和公众接受度方面仍面临诸多阻力,这可能是相关技术产业化所要克服的另一个挑战。
Critical Thinking
虽然体外酶活实验和异源表达实验证实了 GAME15 的葡糖醛酸转移酶活性,但其在植物体内的底物特异性如何?是否存在 GAME15 催化其他类型糖基化修饰的可能?这可能还需要更多的体内实验数据支持。 论文提出 GAME15 与其他酶形成代谢区室,实现底物的高效传递。但除了间接的示踪实验外,缺乏对这种超分子复合物的直接结构解析。利用 Cryo-EM 等技术对其进行可视化分析,或许能提供更有力的证据。 GAME15 突变体中 SGA 合成受阻是否完全是因为酶促反应被抑制?是否可能因代谢物异常积累引发了某些未知的调控效应?这可能还需要通过代谢组学和转录组学等手段深入分析代谢变化对植物的系统性影响。 论文主要关注了 GAME15 对 SGA 合成的影响,但对其突变体产生的表型变化(如图S22所示)缺乏深入分析。GAME15 功能缺失是通过何种机制影响植物生长发育的?这可能还需要整合生理生化和组学等多层次数据加以阐释。 虽然论文提出 GAME15 有望应用于 SGA 代谢工程,但距离实际应用尚有差距。如何整合基因工程、酶工程和合成生物学策略来优化 SGA 的异源合成效率和稳定性,仍是一个亟待解决的问题。此外还需要考虑目标代谢产物的生物安全性评估和监管审批等因素。
Biosyn导师：Asaph Aharoni
https://www.weizmann.ac.il/plants/aharoni/home
Asaph Aharoni 教授是植物次生代谢研究领域的国际知名学者。他目前担任以色列魏茨曼科学研究所植物与环境科学系主任。Aharoni 教授在耶路撒冷希伯来大学获得硕士学位,并在荷兰瓦赫宁根大学获得博士学位。之后,他在瓦赫宁根植物研究国际研究所完成了博士后研究。
Aharoni 教授是最早将 DNA 微阵列用于大规模基因表达分析的科学家之一,也是代谢组学领域的先驱,开创性地应用代谢组学技术对植物代谢物进行全面分析和非靶向鉴定。他的研究兴趣集中在揭示植物次生代谢产物生成的分子机制,以及这些分子在植物与其他生物相互作用中的作用。他的实验室结合前沿的代谢组学、分子遗传学、生物化学和计算生物学等方法,研究植物发育和胁迫条件下的次生代谢。此外,Aharoni 团队还常规开展复杂的代谢工程项目,并致力于开发植物天然产物的创新商业应用。
Aharoni 教授曾担任以色列质谱学会主席和以色列分析化学学会执行委员会成员。他目前是植物科学领域顶级期刊 The Plant Journal 的编委,也是德国 Golm 马克斯普朗克分子植物生理学研究所科学咨询委员会成员。此外,他还曾在中国福州园艺生物学和代谢组学中心的科学咨询委员会任职。
Aharoni 教授获得过多项荣誉,包括欧洲研究理事会授予的 "starting" (2007) 和 "advanced" (2019) 独立研究者基金,以及魏茨曼研究所授予的 Andre Deloro 杰出科学家奖。他还获得过 James Heineman 生物与生物医学研究奖、魏茨曼研究所科学理事会奖 (Levinson 生物学奖) 和以色列高等教育理事会颁发的 Yigal Alon 奖学金。2020年,Aharoni 教授获得美国植物生物学会授予的 Enid MacRobbie 奖,表彰美国以外的杰出植物生物学家。
迄今为止,Aharoni 教授已发表了 180 多篇研究论文和 30 章专著,并申请了 30 项专利。在过去几年里,他的实验室研究成果催生了五家初创公司,为植物保护、天然色素生产、营养作物培育、乳制品替代品开发以及新型大麻素药物研发等领域提供了众多解决方案。
