研究目标及意义
这项研究于2024年11月13日在线发表于Science。目标是开发一种新的基因组工程技术-ACTIMOT (Advanced Cas9-mediaTed In vivo MObilization and mulTiplication)【人工模拟高级体内遗传物质移动和增殖技术】,从而更高效地从细菌生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)中发现新的天然产物(natural products, NPs)。这一研究的主要意义有:
- 抗菌素耐药性 (antimicrobial resistance, AMR)
是全球性的重大健康威胁,寻找新型抗生素至关重要。天然产物是新药开发的重要来源,在过去40年FDA批准的小分子药物中占66.8%。但目前传统的天然产物研究遇到瓶颈。 基因组研究表明,很多细菌中存在大量天然产物的生物合成潜力尚未得到利用。BGCs 负责产生具有多样生物活性的天然产物及其类似物,包含从数千碱基到超过 100 kb 的多个基因。如何有效利用这些隐藏的生物合成潜力,成为该领域的关键问题。 以往有多种方法来发掘BGCs的功能,但在克隆和活化大片段BGCs方面还存在局限。本研究受抗性基因转移机制启发,旨在突破技术瓶颈,加速新天然产物的发现与开发。
We aimed to artificially mimic this mechanism to facilitate the "mobilization-relocation-transfer" process for large DNA fragments in bacteria, such as biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for producing natural products.
The disconnection between the enormous biosynthetic potential of BGCs and our limited knowledge of encoded chemical entities highlights the need for alternative approaches to accelerate the discovery of what are now known as "cryptic" NPs.
综上,这项研究针对当前天然产物研究和新药开发的核心痛点,提出一种创新的基因组工程策略。若能建立高通量发掘BGCs的技术平台,将极大推动新型药物活性成分的发现,为解决抗性危机提供新的候选物。从商业角度,这有望催生出天然产物领域的新技术、新药物及投资机会。
研究思路与方法
ACTIMOT 的核心思路是模拟抗性基因自然传播过程中的"动员、定位、转移"机制:
动员(mobilization):利用CRISPR-Cas9基因编辑系统 从细菌基因组释放目标BGCs 定位(relocation):把释放的BGCs"捕获"到高拷贝的质粒上 转移(transfer):通过同源重组(homologous recombination) 实现BGCs从染色体向质粒的跳跃,增加其拷贝数
这种策略的关键优势有:
能够克隆大片段BGCs(>100kb),突破了传统分子克隆在操作大片段基因组DNA方面的限制 通过定向"剪切"和"粘贴",使BGCs高效地从染色体转移到工程质粒,避免了从头克隆和构建的繁琐步骤 通过增加BGCs的拷贝数,直接提高BGCs的表达和天然产物的产量,利用基因剂量效应(gene dosage effect) 实现单个基因簇的活化 若"动员"的BGCs在原始宿主中受到抑制,可进一步将含有目标BGCs的工程质粒导入到其他异源表达宿主,提高目的产物的合成
具体来看,ACTIMOT 设计了两类质粒:
含 Cas9 和 sgRNA 的"释放质粒" (pRel),靶向切割染色体两端的目标DNA区域(TDR) 含 BAC 骨架和同源臂(homologous arms, HAs) 的"捕获质粒"(pCap),通过同源重组招募游离的 TDR 片段
如图2A 所示,pRel 和 pCap 协同发挥作用:
To mobilize a specific TDR from the bacterial chromosome, a functional pRel carrying two sgRNA spacers targeting the two ends of TDR is required to ensure accurate cleavage on the chromosome (Fig. 1B). Simultaneously, a functional pCap harboring a specific spacer–protospacer adjacent motif (PAM) cassette between the pair of homologous arms (HAs) is cleaved by sgRNA-Cas9, exposing the HAs, CapL, and CapR. The linearized pCap, the destination for BGC relocation, captures the mobilized TDR fragment through homologous recombination.
此外,研究还开发了融合型 pRelCap 质粒,将释放和捕获功能整合为一体,进一步简化操作步骤、提高克隆效率。
总之, ACTIMOT 利用基因组编辑、同源重组等前沿技术,模拟了一种"动员-定位-转移"的遗传操纵范式。相比现有方法,它在高通量克隆和定向活化大片段BGCs方面具有独特优势,有望成为加速天然产物发现的利器。
本文开发了一种新的基因组工程技术ACTIMOT(Advanced Cas9-mediaTed In vivo MObilization and mulTiplication),通过模拟抗性基因的自然传播机制,实现了细菌中大片段DNA的"动员-定位-转移"。运用这一方法,作者从链霉菌中发现了4类39个新天然产物,突破了以往基因簇发掘的瓶颈,极大拓展了已知天然产物的化学空间。
ACTIMOT 实现大片段DNA 的高效克隆和定向重组
ACTIMOT 的核心特色是利用CRISPR-Cas9系统和同源重组,在体内实现大片段异源DNA 的剪切、跨位点转移和克隆扩增。这一过程借鉴了抗性基因自然传播的分子机制:
We aimed to artificially mimic this mechanism to facilitate the "mobilization-relocation-transfer" process for large DNA fragments in bacteria, such as biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for producing natural products.
作者设计了两类核心工具质粒:pRel 负责靶向切割目标DNA 区域(TDRs),pCap 则通过同源臂招募游离的TDRs。两者协同作用,使目标基因簇从染色体转移到高拷贝质粒(图1B)。
图1
以放线菌中的24kb 砖红色素(Act)基因簇为例,作者构建了靶向pRel 和pCap 质粒,通过接合将其导入宿主菌。PCR 验证表明,15个外源接合子中Act 基因簇均成功转移到pCap(图S5)。进一步电泳实验证实pCap-Act 质粒的完整性(图S5)。图2B 直观展示,获得pCap-Act 的重组菌株(M145 和S.lividans)产生了更多的砖红素：
图2
这些结果有力证明了ACTIMOT 体系的可行性。与常规克隆相比,它在操作大片段异源DNA(>100kb)方面展现出明显优势,为后续更大规模的基因簇挖掘奠定了基础。
从链霉菌中发现阿维司他肽类和avidilipopeptins
在前期验证的基础上,作者选择了链霉菌S.avermitilis 中一个48kb 的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇Sav11 进行挖掘。该区域包含两个亚基因簇avs 和avl(图3A),生物信息学分析提示其可能产生新颖化合物。
研究人员构建了pRelCap-Sav11 质粒,将其导入宿主菌,通过PCR 和测序验证了Sav11 的成功克隆(图S8, S9)。值得一提的是,融合型pRelCap 质粒的使用极大简化了操作流程,使基因簇动员效率接近100%(图S8)。作者写到:
Similarly to the dual-plasmid approach, we easily obtained and verified the correct exconjugants harboring the pCap-Sav11 (fig. S8C). All E. coli colonies were confirmed to carry the correct pCap-Sav11 after transformation with the plasmids extracted from Streptomyces exconjugants (fig. S8D), indicating improved efficiency of the single-plasmid ACTIMOT versus the dual-plasmid system for BGC mobilization (fig.S8E).
然而原始宿主中Sav11 的表达仍然很低。将pCap-Sav11 导入异源表达宿主S.albus Del14 后,色谱分析检测到大量新峰(图3B,D,E)。进一步通过核磁共振和质谱分析,鉴定出22个新化合物,命名为阿维司他肽(图3C)和avidilipopeptins(图3F)。
We named the peptide families avidistatins (1 to 7) and avidilipopeptins (8 to 22) (Fig. 3, C and F, and fig. S19). Their corresponding BGCs were confirmed through gene deletion on the pCap-Sav11 (fig. S20).
该研究揭示了NRPS 途径多样化产物的分子机制,包括A结构域底物选择的多变性,以及可选的聚合链释放模式(图S21-S22)。这些发现拓宽了已知NRPS 肽类天然产物的结构空间,同时展示了ACTIMOT 发掘隐藏基因簇的强大功能,突破了以往方法的局限性。
通过BGC 扩增提高mobilipeptin 产量,揭示环肽前体分子
借助单质粒ACTIMOT系统,作者进一步对S.armeniacus中一个67kb的PKS-NRPS 混合基因簇Sar13进行了克隆(图4A,S9B,S23)。Sar13 隶属于一类含"梯烷"结构的BGC 家族,但其产物尚未见报道.
图4
将pCap-Sar13 导入原始宿主后,一系列新天然产物mobilipeptin 的产量提高了近40倍(图4B,S25):
The mobilization and multiplication of Sar13 promoted the discovery of a series of metabolites that we named mobilipeptins. The yield of mobilipeptins in the mutants carrying mobilized Sar13 increased nearly 40-fold (Fig. 4B and fig. S25).
结构解析发现, mobilipeptin A和B 是一类新颖的脂肽,含有线性共轭多烯链和非常见的阿米基酸残基如2,3-二氨基丁酸(Dab)(图4C)。通过优化培养条件,作者还检测到了四个短暂存在的前体化合物mobilipeptin D-E(图4D),其结构特征与生物合成机制预测高度吻合(图4E):
To explore the possibility of a structurally different primary product, we conducted fermentation under varying conditions. Numerous attempts resulted in the detection of short-lived products from the Sar13-activated mutant with corresponding molecular ions of [M+H]+ = 571.29 (26, mobilipeptin D) and 553.28 (27, mobilipeptin E) at retention times of 6.7 and 7.5 min, respectively (Fig. 4D and fig. S30).
这些发现揭示了一个复杂的多肽后修饰过程,涉及环化、降解等多个步骤(图S34)。基于此,作者提出Sar13可能先生成环四肽前体,再经酶促/自发降解产生观察到的mobilipeptin A-B 等系列衍生物。这一研究深化了对PKS-NRPS混合途径的生物合成认知。同时,ACTIMOT 不仅提高了最终产物的产量,还捕捉到了关键的中间体,充分展现了对复杂天然产物生物合成的探索能力。
发现苯并恶唑类化合物actimotin 及其隐蔽的生物合成基因簇
最后,作者对S.avidinii 中一个高达149kb 的DNA片段Sav17 进行了发掘。这个区域被认为包含一个巨大的NRPS基因簇(图5A)。不出所料,利用pRelCap-Sav17 对TDR 进行克隆,PCR和测序结果证实了这一大片段DNA在外源重组子中的成功整合(图S9C,S37)。
图5
通过在原始宿主和异源表达宿主中进行发酵,作者发现一系列新的苯并恶坐类化合物actimotin 的产量显著提高(图5B):
In the S. avidinii mutants carrying pCap-Sav17, we identified a series of highly yield-improved compounds that were easy to neglect in the WT strain because of their meager production (Fig. 5B). This observation indicated the activation of a cryptic BGC within Sav17.
系统的波谱分析最终确定了11个actimotin 衍生物的结构(图5C),特点是含有稀有的间位取代苯并恶唑骨架和2-氨基环己醇侧链。有意思的是,在Sav17 中并未发现已知的苯并恶唑生物合成基因。通过系统的基因敲除实验(图S47),作者最终确定了编码actimotin 的隐蔽基因簇amo:
We did not find the reported benzoxazole BGC in sav17 (56). The only plausible candidate is an upstream 20-kb region enriched with various biosynthetic genes, including discrete A domain genes, which we initially presumed to be part of the giant NRPS BGC. Through gene deletions and heterologous expression of the modified sav17 (Fig.5A, fig. S47, and table S11), we confirmed that this cryptic 16-gene region is responsible for actimotin biosynthesis, distinct from the giant NRPS BGC.
这一结果突出了ACTIMOT 在揭示功能未知基因簇方面的优势。进一步的同源性分析发现,类似amo 的隐蔽基因簇广泛存在于放线菌中,表明actimotin 类化合物可能代表了一类尚未被发掘的天然产物家族。值得一提的是,尽管actimotin 对常规指标活性有限,但actimotin J展现了与已知药物tafamidis 相当的TTR 蛋白稳定活性(图S50),具有成药潜力。
Actimotin J exhibited activity in a similar range, with an EC50 value of 67.8 mM (fig. S50B). ......Our finding holds promise for discovering further actimotin derivatives exhibiting TTR amyloidogenesis inhibition activity from the identified amo-like BGCs.
该研究再次彰显了ACTIMOT 克服传统基因簇发掘瓶颈的能力。基于对大片段DNA 的体内定向重组和异源表达,该系统不仅能提高已知天然产物的产量,更可发现隐蔽的全新基因簇,极大扩展了可供药物研发的先导化合物空间。
小结
ACTIMOT 作为一种新型的基因组工程策略,突破了以往天然产物研发的诸多瓶颈。通过模拟抗性基因的自然传播机制,它实现了NRPS/PKS 等复杂基因簇的体内定向重组、克隆和异源表达,极大提高了目标化合物的产量。更重要的是,ACTIMOT 能发掘出传统方法难以企及的隐蔽基因簇,发现结构新颖的天然产物。本文在两个链霉菌中鉴定出4大类39个新化合物,充分展示了这一策略在突破基因组complexities、加速药物发现方面的能力。这些发现为优化工具、拓展底盘、建立高通量筛选平台提供了新思路,有望极大加速微生物次生代谢的系统发掘。从学术价值看,ACTIMOT 为阐明复杂天然产物的生物合成机制提供了新工具;从应用前景看,该成果有望为抗生素研发开辟新路径。毋庸置疑,这项突破性的研究成果必将引领天然产物研究进入新的高度。
学术价值与应用潜力
ACTIMOT 作为一种颠覆性技术,其学术价值和应用前景主要体现在3个方面:
建立高通量发掘、活化隐藏 BGCs 的技术平台。以往很多方法仅适用于个别 BGCs,通量和成功率都较低。而 ACTIMOT 展示出对多个大片段 BGCs(最大达149kb)的高效克隆和异源表达能力。这为建立普适性的 BGCs 挖掘平台奠定了基础。若能与生物信息学、合成生物学等技术相结合,有望极大加速天然产物的发现和开发。 催生新的药物先导化合物及衍生物。本研究通过对4个 BGCs 的激活,发现了22个 avidilipopeptins、7个 avidistatins、5个 mobilipeptins 和11个 actimotins 等系列新化合物。虽然初步活性测试对人体细胞和微生物抑制作用有限,但 actimotin J 表现出一定的 transthyretin(TTR)稳定活性。这提示 actimotins 类化合物在TTR淀粉样变性相关疾病(如家族性淀粉样多发性神经病)治疗方面具有潜力。 为抗菌素耐药性危机提供新的候选先导化合物。通过生物信息学分析,研究者发现本研究克隆的4个 BGCs 在不同放线菌中都有同源BGCs分布。其中 actimotin 途径在数据库中检索到383个"暗物质"BGCs (未知产物)。这表明利用 ACTIMOT 对更多菌株的系统发掘,有望得到大量结构新颖的活性天然产物,为新抗生素研发提供物质基础。
We subsequently conducted a comprehensive survey to explore the distribution of amo-like BGCs featuring analogous genes to amo5, amo6, amo7, and amo4/amo8, which are core benzoxazole biosynthetic genes. Among the 383 hits harboring all the four essential genes uncovered, 364 were identified as full-length BGCs and the remaining 19 were fragmented because of sequence quality issues (data S9).
ACTIMOT 代表了BGCs功能基因组研究的新范式。未来若能扩大到罕见放线菌和其他细菌类群,将极大拓展已知天然产物的化学空间,并提供海量先导化合物的宝库。与传统活性筛选相比,这种定向基因组挖掘模式有望成为新药研发的"富矿"。从中长期看,这一研究领域的突破性进展可能引领新一轮药物研发热潮,催生出新技术、新产业和投资机会。
未来方向与技术挑战
文章最后总结了ACTIMOT目前仍存在的局限,以及未来值得探索的几个方向:
扩大ACTIMOT的适用范围,突破对目标菌株遗传操作的依赖。当前该技术仍局限于链霉菌等模式菌,其成功与否依赖于质粒的复制能力和宿主的遗传可操作性。未来需要开发更多的遗传元件如启动子、复制子,以及优化接合等遗传操作手段,从而拓展到稀有放线菌和其他细菌类群。 进一步简化操作流程,实现 BGCs 挖掘的自动化。目前该技术仍需要多步克隆和接合操作,部分环节如缺失质粒的筛选较为繁琐。未来可考虑开发标准化、模块化的工具质粒体系,并与高通量测序、液体操作机器人等平台集成,初步实现从基因组到天然产物分离制备全流程的自动化,显著提高通量和效率。 整合基因组挖掘和化合物表征新技术。随着合成生物学、生物信息学等交叉学科的发展,未来 ACTIMOT 可与基因簇编辑、异源表达优化等技术相结合,实现 BGCs 的定向改造和产量提升。同时也要发展更灵敏、快速的化合物分析和结构解析技术,跟上天然产物的高通量发现步伐。 针对性地发掘特定类型活性分子。本研究侧重于 PKS、NRPS 等复杂的次生代谢产物。而利用ACTIMOT对核糖体合成肽(RiPPs)、萜类等其他天然产物的 BGCs 进行针对性发掘,或许能得到结构更加新颖、活性更强的先导化合物,值得系统尝试。 结合多组学技术,阐明天然产物的生态功能。除了新活性物质的发现,ACTIMOT 或许还能与宏基因组、代谢组学等技术联用,深入研究环境微生物 BGCs 的分布规律、进化特征和生态功能,揭示天然产物在微生物群落互作和环境适应中的重要作用。
Critical Thinking
目前的研究仅限于链霉菌,对该技术在其他类群的适用性尚缺乏验证。关键是质粒复制和遗传操作体系能否适配。未来需要开发广谱的遗传工具,扩大技术普适性。 虽然异源表达能激活隐藏的 BGCs,但并非所有 BGCs 都能在模式宿主中正确表达,可能存在复杂的调控机制未被重构。结合合成生物学改造可能是未来方向。 本研究获得的新天然产物大多缺乏明确的生物活性。这可能与实验对象、测活方法等因素有关。未来可结合基因组信息,有针对性地选择可能与特定活性相关的 BGCs,提高发现效率。 对所发现的天然产物,尚缺乏系统的构效关系和作用机制研究。特别是 actimotins 与已知药物 tafamidis 结构相似但活性有限,提示我们发现新骨架分子后,可能还需要进一步的医药化学优化。 本文虽发现了数百个 actimotin 同源 BGCs,但仅鉴定了其中 2 个。对大量"暗物质"BGCs 的功能挖掘,仍存在效率瓶颈。智能优先排序、高通量异源表达等技术迭代非常必要。
Biosyn导师：傅成章
https://www.helmholtz-hips.de/en/research/people/person/dr-chengzhang-fu/
傅成章博士于2002年至2006年在中国浙江大学学习生物技术。2011年,他在中国科学院微生物研究所获得生物化学与分子生物学博士学位。2012年,他成为德国萨尔大学Rolf Müller教授课题组的洪堡学者。之后,他继续在萨尔兰药物研究亥姆霍兹研究所(HIPS)与Müller教授合作,担任博士后研究员。2019年,他作为青年课题组长加入HIPS的"亥姆霍兹国际实验室"项目。
Fu博士的研究主要集中在探索和改造来自细菌和环境DNA的生物合成基因途径。他在微生物次生代谢和天然产物研究领域有着扎实的学术背景和丰富的经验。从他的履历来看,Fu博士一直活跃在这一领域的前沿,先后在中国和德国接受了系统的科研训练,并在青年时期就成长为课题组长,展现出卓越的科研能力和发展潜力。
