研究目标和意义
这篇发表在《美国国家科学院院刊》(PNAS) 上的文章研究了一类名为 SfnG 的双组分黄素依赖单加氧酶(two-component flavin-dependent monooxygenase, TC-FMO)催化二甲基砜(dimethylsulfone, DMSO2)碳-硫键(C–S bond)裂解的结构特征。SfnG 来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),在硫饥饿条件下可以利用环境中的二甲基砜作为替代硫源。
正如文章开头指出的,TC-FMO 催化的化学反应在工业生物催化中有重要应用:
FPMO chemistries usually occur via formation of the C4a-(hydro)peroxyflavin pathway, but more recently a subset of monooxygenases are proposed to use an N5-(hydro)peroxyflavin pathway (Fig. 1A) (4–10). Among these redox proteins are two-component flavin-dependent monooxygenases (TC-FMOs), which rely on a separate NAD(P)H-dependent flavin reductase to provide reduced flavin mononucleotide (FMNH–) or flavin adenine dinucleotide (FADH–) (Fig. 1A) (1). FMNH– is a cosubstrate that must be transferred between the reductase and monooxygenase during the reaction cycle. The separation of reductase and monooxygenase activities makes TC-FMOs particularly attractive for bioengineering of the monooxygenase without altering the reductase.
此外,硫同化代谢途径也可能成为抗真菌药物的潜在靶点:
Additionally, sulfur assimilation pathways are of interest as potential targets against pathogenic fungi (15).
图1. Bacterial sulfur assimilation of DMSO2 in Pseudomonads under sulfur starvation conditions requires TC-FMOs SfnG, MsuC, and MsuD.
通过对二甲基砜降解过程的关键酶 SfnG 的深入研究,有望揭示其催化机制,为催化剂工程和抑制剂开发提供新的思路。
研究方法和创新点
本文主要采用了 X 射线晶体学、生物物理学和生物化学等方法,对 SfnG 的结构和功能进行了系统的研究,主要创新点包括:
测定了 SfnG 无配体和结合 FMN + DMSO2 的高分辨率晶体结构(2.6 Å 和1.75 Å )。晶体结构揭示了 SfnG 采用一种独特的四聚体构象,不同于其他四聚体 TC-FMO。 通过色谱和光散射实验验证了配体结合与四聚体构象的相关性。 通过比较无配体和结合状态下的结构差异,揭示了 FMN 和 DMSO2 结合引起的构象变化和活性位点重排。特别是首次观察到氧结合位点附近一种新的蛋白骨架构象。 结合活性实验和对接研究,验证了 SfnG 可能通过 N5-(羟)过氧黄素(N5-(hydro)peroxyflavin)中间体机制裂解多种二烷基砜的 C-S 键。
此外,文章还测定了整个 DMSO2 代谢通路中几个关键酶与FMN 的结合常数,为理解黄素在通路中的传递提供了数据支持。
SfnG独特的四聚体结构与配体结合的关系
作者通过结合凝胶色谱、多角度光散射等生物物理方法,揭示了SfnG采用一种"蝴蝶形"四聚体结构,而这种寡聚状态受配体调控。
Initial SEC purification of SfnG resulted in the elution of two species best matching a dimer and tetramer, creating ambiguity regarding the functional quaternary structure (SI Appendix, Fig. S4C). We hypothesized that high salt could disrupt the tetramer assembly; therefore, SfnG was incubated in high (500 mM NaCl) and low (100 mM NaCl) salt conditions and analyzed by analytical size exclusion chromatography (aSEC) (SI Appendix, Fig. S5)...suggesting salt indeed disrupts the tetramer.
高盐条件下解聚为二聚体,而低盐有利于四聚体形成。进一步用SEC-MALS和DLS考察配体效应(图3E, F):
...SEC-MALS revealed the introduction of FMN and DMSO2 at 5× molar excess shifted retention time to 11.3 min with a molecular weight of 160 kDa by MALS and two minor peaks at 7.5 min and 10 min, corresponding to higher molecular weight aggregates. The presence of FMN or FMN+DMSO2 similarly decreased the population of the 3.8 nm radius species assigned to the dimer, restoring a lower % PD and a radius of the tetramer by DLS, whereas DMSO2 alone had no effect.
图3
FMN与DMSO2结合可使酶聚集为约160kDa四聚体,且DMSO2结合依赖FMN。这表明底物和辅因子对维持SfnG功能性寡聚状态至关重要,暗示四聚体界面可能参与调控酶活性。此前TC-FMO家族已知存在二聚体和椭圆形四聚体,但SfnG的"蝴蝶形"四聚体尚属首次发现。
晶体结构揭示SfnG 活性位点构象变化与配体结合模式
作者测定了SfnG游离态(2.6Å)和FMN、DMSO2结合态(1.75Å)的高分辨率晶体结构。两种状态叠合(附图S8A)显示:
A comparison of the liganded and unliganded SfnG structures shows how exposed the active site is without ligands, suggesting conformational changes occur once substrates are bound to close off the active site from bulk solvent (Fig. 4 A and B).
配体结合引起活性中心的构象重排,从溶剂暴露转变为封闭构象,为高效催化提供结构基础。
FMN与DMSO2电子密度清晰可辨(图4C, D):
图4
An analysis of FMN binding residues reveals the phosphoryl binding motif including residues H136, Y140, S188, and S189 that are conserved in SfnG (SI Appendix, Fig. S7) as well as within class C flavin-dependent monooxygenases. The ribityl moiety is positioned by backbone interactions of G120 and G186 and sidechain interaction with N284 (SI Appendix, Figs. S8G and S9)...Residue W121 in the unliganded structure was extremely disordered in each chain but becomes positioned to interact directly with the isoalloxazine ring through hydrogen bonding with N1 (Fig. 4C and SI Appendix, Fig. S8E).
FMN磷酸基团与保守残基形成多重氢键,核糖基团也受骨架及侧链稳定。游离态中无序的W121在结合态与异咯唑啉环N1形成关键氢键。
Tetrahedral electron density is observed at the si-face of the isoalloxazine ring for DMSO2...Residues W121 and R55 are involved in FMN binding and positioned to donate hydrogen bonds to the DMSO2 oxygen atoms, and residue N297 is positioned to hydrogen bond to the second oxygen of DMSO2. The dimethyl groups of DMSO2 are positioned toward an aromatic cage made up of residues W11 and Y60 of the (β/α)8 barrel and F267, W285, and Y296 of the lid region within IR-3.
DMSO2 结合于FMN si面,其氧原子分别与W121、R55、N297侧链形成氢键网络,双甲基则插入芳香笼疏水环境。这些相互作用共同决定了底物在活性位点的精确定位。
基于N5过氧化物捕获和突变实验验证SfnG催化机制
为探究SfnG催化C-S键断裂的分子机制,作者开展了一系列生化实验。首先用LC-MS监测SfnG催化二乙基砜这一非天然底物的反应,在产物中捕获到FMN N5-氧化物:
When SfnG from P. fluorescens was supplied diethylsulfone, an alternative substrate shown to incompletely react in an NMR endpoint assay, both FMN and the N5-oxide were detected as products by LC–MS.
由于二乙基砜位阻效应,反应不完全,生成"脱轨"的N5-氧化副产物,提示SfnG可能经由N5过氧黄素中间体催化底物。
接着作者考察了氧结合口袋关键残基N116和Q53的作用。N116E突变体无法形成N5-氧化物,表明:
The lack of observed flavin N5-oxide by the N116E variant is consistent with a role for N116 in stabilizing the polar transient superoxide species before radical coupling with the N5 position of the isoalloxazine ring.
突变引入Glu残基阻碍超氧物种结合,N116可能在稳定该瞬时自由基中间体,利于其与FMN N5位偶联形成过氧化物方面发挥关键作用。
Q53位于FMN re面及si面底物结合位点之间。Q53E突变体同样未检出N5氧化副产物:
Mutation of Q53 to alanine caused the protein to become insoluble; however, Q53E was soluble and interestingly showed no measurable flavin N5-oxide species generated when assayed with diethylsulfone.
表明Q53参与传递构象信息,影响底物结合和催化过程。综合晶体学和生化数据,SfnG极可能依赖N5过氧黄素歧化的非经典催化机制,实现C-S键选择性断裂。
SfnG催化C-S键断裂底物适用范围考察
为了解SfnG底物适用范围,作者比较了二甲基、二乙基和乙基甲基砜三种底物的反应性。NMR实验(图6A)表明,SfnG可以催化断裂后两种底物C-S键,生成相应的亚砜酸盐。分子对接研究也揭示,尽管结合模式不甚理想,但二乙基砜仍可被SfnG转化(图6C):
图6
Docking experiments similarly confirmed nonoptimal positioning of diethylsulfone for the reaction. The C1 position of ethyl-containing sulfones was found to dock in a state that is not optimal for either SN2 attack or hydroxylation, suggesting additional movements may be needed for reactivity, which may be amenable from the dynamic active site lid region.
活性位点盖区的柔性可能有助于调节底物构象,拓宽SfnG催化谱。这些结果阐明了SfnG对二烷基砜类化合物的催化机制和适用范围。
小结
这项研究系统阐明了SfnG催化DMSO2碳硫键裂解的结构基础和分子机制。作者发现SfnG形成独特的"蝴蝶形"四聚体,受底物和辅因子调控;活性位点存在显著构象重排,形成疏水芳香笼和极性残基网络,与底物和FMN形成多重相互作用;N5-氧化物捕获和突变实验支持N5过氧黄素歧化催化机制。同时,NMR和对接研究揭示SfnG对含C2侧链底物也有一定催化活性。这些发现极大深化了我们对SfnG催化机制的理解,为该酶的定向改造及抑制剂开发奠定了坚实基础,在工业生物催化和抗菌药物研发领域具有广阔的应用前景。
对学术界和产业界的影响
SfnG 高分辨率晶体结构的解析不仅加深了我们对其催化碳硫键断裂分子机制的理解,也为 TC-FMO 酶催化剂的设计和改造提供了重要结构基础。例如,通过对活性位点关键残基的定点突变,可能实现对底物特异性、区域选择性和催化效率的调控。这对于开发高效的含硫化合物生物脱硫催化剂具有重要意义。
此外,SfnG 独特的四聚体结构与其他同类酶不同,结合位点暴露在四聚体组装界面上。这一结构特点启示我们可以通过调控 SfnG 寡聚化状态和界面性质,来影响其对 FMN 辅因子的结合和传递。深入研究该结构与功能的关系,有望为开发全新的四聚体界面抑制剂提供思路。鉴于 SfnG 硫源同化通路在真菌致病过程的重要作用,这类抑制剂可能具有广阔的医药应用前景。
未来研究方向与机遇
尽管本研究对 SfnG 催化裂解 C-S 键的分子机制有了深入认识,但仍有一些问题值得进一步探索:
SfnG 催化过程中N5过氧化物中间体的动力学行为如何?它是如何与底物发生反应的?这可能需要快速动力学等手段予以表征。 SfnG 四聚体界面在底物和辅因子结合过程中发生了哪些动态变化?它们与催化效率有何关联?采用 X 射线自由电子激光、单分子 FRET 等技术或许可以实时监测这一过程。 晶体结构揭示的氧结合口袋附近的蛋白质构象变化在感知氧分子结合方面有何作用?如何影响催化?这需要结合分子动力学模拟和位点特异性标记光谱等实验方法深入研究。
Critical Thinking
晶体结构代表的是酶分子的静态"快照",尚难以反映催化过程中的动态构象变化。这可能需要引入计算模拟、溶液NMR、时间分辨光谱等技术加以补充。 本文主要关注 SfnG 单个酶的结构功能,对其与上下游酶和黄素还原酶的相互作用及传质过程关注不足。多组分酶级联体系的动力学研究将有助于从整体上理解和优化硫化合物代谢通路。 本研究未能捕获和表征关键的 N5过氧黄素中间体。它的形成、异构化和与底物的反应机制还有待更直接的实验证据支持,如rapidquench流动技术与质谱联用等。 SfnG 对含硫底物的催化效率、选择性等并未见系统的定量分析。不同来源 SfnG 酶的比较研究也有助于阐明序列-结构-功能间的内在联系,为定向进化和理性设计提供更丰富的信息。
http://dpdowlinglab.net/
Biosyn导师：Daniel P. Dowling
http://dpdowlinglab.net/
Daniel P. Dowling是马萨诸塞大学波士顿分校化学系的助理教授,主要从事生物化学研究。他于2004年在圣十字学院获得化学和音乐双学士学位,师从Josh R. Farrell教授开展本科研究,合成了多齿氨基苯硫酚配体。
2009年,Dowling博士在宾夕法尼亚大学获得化学博士学位,师从David W. Christianson教授开展博士论文研究,他的论文题目是"两种相关金属水解酶的结构研究:人组蛋白去乙酰化酶8和疟原虫精氨酸酶",系统阐述了这两种重要酶的结构功能关系。
随后,Dowling博士在麻省理工学院/霍华德·休斯医学研究所(HHMI)化学系,跟随著名结构生物学家Catherine L. Drennan教授从事博士后研究,这一经历进一步提升了他在蛋白质结构与功能领域的专业素养。
2014年起,Dowling博士受聘于麻省大学波士顿分校化学系,成为一名助理教授。他建立了自己的研究组,致力于利用X射线晶体学、光谱学等多种技术,研究酶催化反应的分子机制,尤其是黄素依赖型单加氧酶催化碳-硫键断裂的结构基础和动力学过程。同时,他还对疾病相关酶如组蛋白去乙酰化酶等的药物设计和调控开展了卓有成效的工作。
