研究目标:发现新型双核铜依赖型 C(sp3)-H 键卤化酶
本论文的核心研究目标是发现和表征一种全新的、铜依赖的 C(sp3)-H 键卤化酶 ApnU,它属于一个广泛存在于真菌次级代谢产物生物合成途径中的未知功能蛋白家族 DUF3328。
Carbon–hydrogen (C–H) bonds are the foundation of essentially every organic molecule, making them an ideal place to do chemical synthesis. The key challenge is achieving selectivity for one particular C(sp3)−H bond.
有机分子几乎都是由碳氢键构成的,因此选择性地对特定 C(sp3)-H 键进行化学合成修饰是有机合成领域的一大挑战。ApnU 能够选择性地对底物分子上多个非活化的 sp3 碳氢键进行迭代氯化,为这一合成挑战提供了酶促解决方案。
Despite substantial progresses in the past two decades, enzymatic halogenation and pseudohalogenation of unactivated C(sp3)−H—providing a functional handle for further modification—have been achieved with only non-haem iron/α-ketoglutarate-dependent halogenases, and are therefore limited by the chemistry possible with these enzymes.
过去20年里,对非活化 sp3 碳氢键进行卤化和拟卤化(引入可进一步修饰的官能团)的酶促反应都局限于非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型卤化酶,因此反应类型也受限于这类酶的化学特性。ApnU 作为首个铜依赖型 sp3 碳氢键卤化酶,有望突破这一局限,实现更丰富多样的酶促碳氢键官能团化反应。
卤素/拟卤素修饰可以改善药物分子的靶向结合力和生物利用度,因此发现新型卤化酶对于开发含卤/拟卤药物分子、拓展药物化学空间具有重要意义。同时,ApnU 所属的 DUF3328 家族在真菌次级代谢产物生物合成中普遍存在,功能尚未阐明,本研究为深入认识该家族酶的结构与功能、开发新型生物催化剂提供了重要线索。
创新方法:铜依赖的双核活性中心实现 C(sp3)-H 键选择性官能团化
Here we report the discovery and characterization of a previously unknown halogenase ApnU, part of a protein family containing domain of unknown function 3328 (DUF3328). ApnU uses copper in its active site to catalyse iterative chlorinations on multiple unactivated C(sp3)−H bonds.
本文发现了全新的卤化酶 ApnU,它含有此前功能未知的结构域 DUF3328。与已知的铁依赖型卤化酶不同,ApnU 以铜作为活性中心辅因子,催化底物分子上多个非活化 sp3 碳氢键的连续氯化(图1)。这是首次在酶促碳氢键活化领域发现铜依赖型催化机制。
图1. ApnU 催化的连续氯化反应
ApnU 含有两个保守的 HXXHC 基序,推测形成双核铜结合位点,与非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型卤化酶的单核铁活性中心有明显区别(图1d)。EPR 光谱实验证实酶的活性中心存在两个自旋耦合的二价铜离子,且两个铜的电子结构环境相似(square-planar N/O 混合配位)。
By taking advantage of the softer copper centre, we demonstrate that ApnU can catalyse unprecedented enzymatic C(sp3)−H bond functionalization such as iodination and thiocyanation.
基于铜离子较软的 Lewis 酸特性,研究者发现 ApnU 能够催化碘化、硫氰化等前所未有的 C-H 键官能团化反应(图2e),而铁基卤化酶无法实现这些转化。这突破了酶促碳氢键活化反应的局限性,极大拓宽了可利用的卤素和拟卤素种类。
蛋白质组学和 AlphaFold 结构预测进一步表明,ApnU 是一种二硫键交联的同源二聚体酶(图3)。二聚体界面存在 1 对分子间二硫键(C210-C237')和 2 对分子内二硫键,对酶的活性和稳定性至关重要。双核铜活性中心位于由疏水残基形成的底物通道内部,有利于疏水性底物分子的结合。
基于实验数据,研究者提出了 ApnU 催化碳氢键卤化的分步反应机理(图4):首先,还原态双核铜活性中心(CuI/CuI)与氧分子结合,形成过氧桥连的 CuII/CuII 中间体;然后与卤素结合,并从抗坏血酸获得 1 个电子和 1 个质子,生成 μ-oxyl/μ-hydroxo 桥连的活性亚铁中间体;该中间体从底物分子上夺取 1 个氢原子,生成底物自由基;底物自由基再与铜中心结合的卤素发生结合,得到卤化产物。
1. ApnU 是首个双核铜依赖的 C(sp3)-H 键卤化酶
本文首次在 DUF3328 家族蛋白 ApnU 中发现了双核铜依赖的 C(sp3)-H 键卤化活性。作者通过基因敲除和化学互补实验,证实了 ApnU 负责将化合物 1 转化为 2 和 3:
Reintegration of apnU into the genome of the ΔapnU strain represented as ΔapnU::apnU was carried out as a genetic complementation experiment. Selected extracted-ion chromatograms, EIC(+), are shown. (Fig. 1c)
随后,作者成功获得了可溶性重组 ApnU 蛋白,并证明其催化活性依赖于 Cu(II) 而非其他二价金属离子(图2b):
To assay the activity of ApnU, refolded apo-protein was incubated with 1, ascorbate and various divalent transition metals including Mn(II), Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II) and Zn(II). Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analysis of the reactions showed chlorination of 1 can be achieved only in the presence of Cu(II). (Fig. 2)
进一步研究表明,ApnU 以 O2 为氧化剂,抗坏血酸为还原剂,催化底物 1 发生迭代氯化反应(图1a),产物包括二氯代的 3、三氯代的 4 以及脱氢产物 5。 这些结果证实了 ApnU 是一种新型的铜依赖卤化酶,与已知的非血红素铁依赖卤化酶(图1b)在辅因子和反应类型上有本质区别。
2. ApnU 能催化前所未有的 C(sp3)-H 键碘化、硫氰化等反应
基于铜离子较软的 Lewis 酸特性,研究者进一步考察了 ApnU 对其他卤素/拟卤素供体的耐受性。令人惊喜的是,当以碘离子、硫氰酸根等取代氯离子时,ApnU 能催化底物 1 发生相应的碘化(6)、硫氰化(7)等反应(图2e)。
Interestingly, softer anions such as iodide (I −), thiocyanate (SCN −) and selenocyanate (SeCN −) adducts were also observed, which cannot be achieved using iron-based halogenases. (Fig. 2e)
作者还考察了几种非天然底物,如替代的苯基己酮类化合物 DIF-3。 结果显示,ApnU 能够催化 DIF-3 的氯化、碘化和硫氰化修饰(图2f),表明其具有一定的底物普适性。
图2
以上结果突破了已知酶促碳氢键活化反应的局限性,极大拓展了可利用的卤素和拟卤素种类,为后续开发新型含卤药物分子提供了切实可行的生物催化方案。这主要得益于 ApnU 双核铜活性中心的独特 Lewis 酸性质。
3. ApnU 是二硫键交联的同源二聚体,含有双核 II 型铜中心
(1) 蛋白质组学分析揭示 ApnU 的二聚体结构和二硫键连接方式(图3):
Two intramolecular disulfide bonds (C173–C200 and C253–C277), along with one intermolecular disulfide bond between C210 and C237′ (as well as C210′ and C237) were mapped (Fig. 3d).
突变实验证实,这些二硫键对 ApnU 的活性和稳定性至关重要。
图3
(2) EPR 光谱学实验证实 ApnU 的活性中心含有两个自旋耦合的二价铜离子(图4a):
EPR spectrum of Cu(II)-loaded ApnU revealed a type II Cu(II) signal with spin quantification approximate to two copper atoms per active site (Fig. 4a).
这两个铜离子具有相似的电子结构环境,为 N/O 混合配位的平面四方型。还原态的单价铜可能是催化的起始态。
基于实验数据,作者提出了 ApnU 催化 C-H 键卤化的分步反应机理(图4b),涉及过氧桥连的双核铜中间体、μ-oxyl/μ-hydroxo 桥连的活性物种以及卤素负离子参与的自由基偶联过程。
图4
这一催化机理模型很好地解释了反应对氧气、抗坏血酸和卤素负离子的依赖性,以及碘离子等"软"卤素负离子的高效转化,为 ApnU 及其同源酶的催化机制研究提供了重要线索。
文章核心发现总结
作者发现了 DUF3328 蛋白 ApnU 是一种前所未见的双核铜依赖型 C(sp3)-H 键卤化酶,能够在温和条件下催化迭代氯化反应。更重要的是,铜活性中心赋予 ApnU 独特的底物适应性,使其能利用碘离子、硫氰酸根等"软"卤素负离子,实现此前铁基卤化酶无法实现的 C-H 键官能团化反应。结合生物物理、光谱学、蛋白质组学等实验手段,作者表征了 ApnU 二聚体的结构特征,揭示了其双核 II 型铜中心的配位环境,并提出了合理的催化反应机理。这些发现极大拓展了酶促 C-H 键活化反应的类型,为开发高选择性的生物催化剂提供了全新视角,也为后续研究 DUF3328 家族其他酶的结构功能关系指明了方向。相关成果不仅具有重要的科学意义,而且为药物先导化合物的精准合成提供了新的思路和工具。
新型卤化酶极大拓展酶促碳氢键活化在有机合成和药物开发中的应用
ApnU 作为首个铜依赖的 C(sp3)-H 键卤化酶,有望打破非血红素铁依赖型卤化酶带来的反应局限,实现更丰富多样的酶促 C(sp3)-H 键官能团化反应。其独特的双核铜催化机制,使其能利用碘、硫氰酸根、硒氰酸根等更多种类的卤素和拟卤素供体,生成相应的碳-卤/拟卤键。这些前所未有的酶促转化反应,有望极大拓展药物分子设计和合成的化学空间,为开发新型含卤/拟卤药物分子提供灵感。同时,将双核铜催化模式引入其他类型的 C-H 键活化酶(如单加氧酶、脱氢酶等),有望实现更多新颖、高选择性的酶促碳氢键官能团化反应。
ApnU 所在的 DUF3328 家族广泛分布于真菌次级代谢产物(如杀真菌环肽、吲哚生物碱等)的生物合成基因簇中,但其功能尚未阐明。ApnU 催化机制的发现,为后续深入研究该家族其他酶的结构与功能提供了重要线索。相关工作有望揭示更多新型酶促碳-氢键活化模式,为开发用于分子合成、药物研发的新型生物催化剂提供理论基础。这些潜在的新工具酶不仅可用于优化天然产物的生物合成途径,还可用于构建人工生物合成途径,制备结构新颖的非天然化合物,进一步拓展药物化学空间。
在发酵工业领域,可以利用定向进化等蛋白工程手段,优化 ApnU 及其同源酶对非天然底物(如药物先导化合物)的催化效率、选择性和稳定性,发展绿色、经济的含卤/拟卤药物中间体的酶促合成工艺。结合生物传感、高通量筛选等技术,ApnU 还可被开发为卤代/拟卤代试剂的酶促合成与定量分析工具。此外,引入 ApnU 催化的卤代反应步骤,有望实现复杂天然产物的酶促全合成,或实现天然产物骨架的后期修饰,制备结构更加多样的衍生物。这些应用都具有重要的经济价值和社会影响。
基于本研究,未来在 DUF3328 卤化酶领域还有以下值得探索的科学问题:
ApnU 双核铜活性中心的精细结构如何?两个铜原子如何相互作用?配体和底物如何结合?结合 X 射线晶体学、EPR、XAS 等技术深入表征活性中心结构,有助于阐明其独特的催化机制。 DUF3328 家族的其他酶是否也含有类似的双核铜活性中心?它们在底物选择性和反应类型上有何异同?对代表性同源酶开展结构生物学和酶学研究,有望揭示更多新型酶促碳氢键活化模式。 如何拓展 ApnU 及其同源酶的底物适用范围?引入定向进化等蛋白工程手段,优化这些酶对非天然底物(如药物先导化合物)的活性和选择性,有望实现更多药物分子的精准卤化/拟卤化修饰。 ApnU 的催化机制能否推广到其他类型的 C-H 键活化酶?在单加氧酶、脱氢酶等其他家族酶中引入类似的双核铜活性中心,有望实现更多新型的、高选择性的酶促 C-H 键官能团化反应。 双核铜催化剂的结构特征能否应用于仿生催化剂的设计?模拟 ApnU 活性中心环境,构建新型双核铜配合物催化剂,有望在温和条件下实现 C(sp3)-H 键的选择性卤化/拟卤化,并实现手性控制。
