研究目标和意义
这篇论文于2024年11月11日在线发表于Nature Structural Molecular Biology。研究的目标是解析人**神经酰胺合成酶6(ceramide synthase 6, CerS6)的结构基础和催化机制。CerS6是一种关键酶,负责催化二氢神经酰胺(dihydroceramides)和神经酰胺(ceramides)的合成。这类鞘脂类(sphingolipids)**在调控细胞代谢中扮演重要角色,其异常在肥胖、胰岛素抵抗、肝病等代谢类疾病中有密切关联。特别是由CerS6合成的C16神经酰胺,被认为是一个很有前景的治疗肥胖相关代谢疾病的药物靶点。然而,此前对CerS6的分子作用机制了解甚少,限制了针对其进行药物研发。该研究旨在阐明CerS6在原子水平上的结构特征和催化反应机理,为开发CerS6抑制剂、治疗代谢类疾病提供关键的结构生物学基础。
正如文章引言部分所言:
Ceramides are bioactive sphingolipids crucial for regulating cellular metabolism. Ceramides and dihydroceramides are synthesized by six ceramide synthase (CerS) enzymes, each with specificity for different acyl-CoA substrates. Ceramide with a 16-carbon acyl chain (C16 ceramide) has been implicated in obesity, insulin resistance and liver disease and the C16 ceramide-synthesizing CerS6 is regarded as an attractive drug target for obesity-associated disease. Despite their importance, the molecular mechanism underlying ceramide synthesis by CerS enzymes remains poorly understood.
由此可见,阐明CerS6的分子机制,对于开发新型代谢类疾病治疗药物具有重要意义。
新思路和方法
本研究采用了**冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)技术,结合质谱(mass spectrometry, MS)**实验,研究了人CerS6在催化过程不同阶段的结构特征。主要创新点包括:
解析了CerS6与一种抑制剂**伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)**结合后的复合物结构,阐明了其抑制机制,为设计CerS6抑制剂提供了重要启示。
发现CerS6含有一个共价连接的棕榈酰基,验证了其催化采用"乒乓(ping-pong)"机制,即先与酰基辅酶A底物反应形成共价酰基-酶中间体,再与鞘氨醇底物反应生成最终产物。这一机制对理解CerS6的底物选择性和调控机制很有帮助。
鉴定了CerS6催化口袋中的关键氨基酸残基,并通过定点突变实验验证了其作用,为后续的机制研究和药物设计提供了重要线索。
以上这些发现都得益于先进的冷冻电镜技术,使得CerS6酶活性构象的捕获成为可能。此外,质谱实验直接验证了酶与底物/抑制剂共价结合物的形成。两者结合,可以全面阐述CerS6的作用机制。相比之前的方法(如同源建模等),本研究在分辨率和实验验证上都有了本质提升,为该领域的研究树立了新的标杆。
论文关键结果解读
一、解析了人CerS6酶的冷冻电镜结构,揭示其三维空间组成和跨膜拓扑
作者利用冷冻电镜(cryo-EM)技术,结合纳米抗体,解析了人CerS6酶的二聚体结构,分辨率达到2.95-3.22埃(图1)。这是首次在近原子分辨率下观测CerS6的三维结构。
正如文章所述:
The cryo-EM structure reveals a CerS6 homodimer with one nanobody bound per monomer on the luminal face and a lipid adjacent to the dimer interface (Extended Data Fig. 3e and Supplementary Note 1). Each monomer has seven TM helices (Fig. 1b,c), with the dimer interface formed by TM1a, the C-terminal end of TM3 and the TM3–TM4 loop. The TLC domain (TM2–TM7) forms a barrel containing two sets of three-TM units arranged as inverted repeats (Extended Data Fig. 4a), while TM1 is attached to the outside of the barrel through contacts with TM2 and TM3.
从图1可以清晰看到CerS6的跨膜区包含7个跨膜螺旋(TM1-7),其中TM2-7组成TRAM-Lag1-CLN8(TLC)结构域,呈现为两组三螺旋的反向重复排列。而TM1则通过与TM2、TM3的相互作用附着在TLC结构域外侧。二聚体界面主要由TM1a、TM3 C端及TM3-TM4 loop构成。
图1. 人CerS6二聚体冷冻电镜结构
这一结构不仅揭示了CerS6的整体组成,更重要的是,为深入研究该酶的催化机制和调控奠定了坚实基础。过去由于缺乏高分辨率结构,严重限制了对CerS家族酶的机制理解。而本研究突破了这一技术瓶颈,实现了对CerS6的精细结构解析,具有里程碑式的意义。
二、鉴定了CerS6催化过程形成的共价酰基-酶中间体 ,支持"ping-pong"反应机制
通过冷冻电镜和**质谱(mass spectrometry)**实验,作者发现纯化的CerS6含有一个共价连接的棕榈酰基(图1e,2a,3b):
The cryo-EM density map revealed the presence of a long density extending from near the membrane midpoint to the occluded ER end of the central cavity, spanning the entire length of the narrow tunnel (Figs. 1d and 2a). This density was continuous between protein and the unknown molecule, suggesting a covalent modification by a lipid. To probe the presence of covalent adducts, we performed denaturing intact protein MS analysis of purified protein samples and identified a +238.45-Da mass shift (Fig. 1e and Extended Data Fig. 1f,g). Notably, this adduct mass agrees with a covalently attached C16:0 acyl chain (theoretical: +238.41 Da).
图2. CerS6含有一个共价连接的棕榈酰基,深埋在膜内
图2 c-e 进一步显示,这一棕榈酰基深埋在由TM4、5、7围成的狭长疏水隧道内,与位于隧道中部的His211共价相连。其长度与CerS6选择性催化C16-CoA底物合成C16神经酰胺的特性相符。
随后作者通过质谱实验证实(图3),这一酰基-酶共价中间体可与鞘氨醇反应生成二氢神经酰胺产物,表明其在酶催化过程中扮演关键角色:
To investigate whether the acylated enzyme species corresponds to a real catalytic intermediate, we incubated the purified protein with the enzyme's second substrate, the long-chain base sphinganine (Fig. 3a). Using denaturing intact protein MS, we observed the complete loss of the C16:0-modified protein after sphinganine addition (Fig. 3b and Extended Data Fig. 6a). Furthermore, HRMS revealed that incubation of the acylated protein with sphinganine led to the production of C16:0 dihydroceramide (observed m/z: 540.5380; theoretical m/z: 540.5350; mass error: +5.55 ppm) (Fig. 3c).
图3. 质谱实验揭示CerS6催化过程中的共价酰基-酶中间体
综合以上结构和质谱数据,作者提出CerS6催化反应遵循"ping-pong"机制(图6):酶先与棕榈酰辅酶A底物反应,生成共价酰基-酶中间体(ping);然后与鞘氨醇底物反应,转移酰基,生成二氢神经酰胺并再生游离酶(pong)。这一机制与经典的双底物结合机制截然不同,为理解CerS6的催化机制和底物选择性提供了全新视角。同时,酰基-酶中间体的捕获,为合理设计共价型CerS6小分子抑制剂提供了新思路。
图6. CerS催化遵循"ping-pong"机制示意图
三、阐明了伏马菌素B1抑制CerS6的分子机制
**伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)**是一种广谱CerS家族抑制剂,但其具体抑制机制此前不清楚。为此,作者解析了CerS6与FB1结合复合物的冷冻电镜结构(图4):
To this end, we incubated purified Nb22-bound acyl–CerS6 with FB1 and determined the complex's structure to a nominal resolution of 2.95 Å (Fig. 4a,b and Extended Data Fig. 8). In comparison to the covalent intermediate state, the overall structure of each CerS6 monomer did not change (TM region backbone r.m.s.d. = 0.39 Å), although the flex ible Hox-like domains rotated by approximately 10o.
图4. CerS6与FB1复合物冷冻电镜结构
结构显示(图5),FB1与酶活性口袋中的棕榈酰基形成了"N-棕榈酰基FB1"加合物,后者占据了酶的底物结合隧道和入口区:
The N-acyl FB1 species spans the entire length of the central cavity, with the acyl chain remaining bound in the narrow tunnel at the occluded ER end of the cavity and the FB1 portion sitting in the wider cytoplasmic entrance (Fig. 4b and Fig. 5b,c). The newly formed amide bond sits in the active site (Fig. 5c), with the carbonyl oxygen form ing a hydrogen bond with Tyr189 (TM3) and the amide NH forming a hydrogen bond with the Nε of His211 (TM4).
图5. N-棕榈酰基FB1在CerS6活性位点的结合模式
分子动力学模拟进一步表明(Extended Data Fig. 9),FB1结合显著降低了CerS6的构象柔性,尤其是在TM6、7、Hox结构域等区域。
这些结果表明,FB1通过诱导酰基-酶中间体生成N-酰基化FB1衍生物,后者稳定结合在酶的活性位点,从而阻断了酶的催化循环(Extended Data Fig. 10)。这一竞争性"自杀性"抑制机制,为理性设计CerS6选择性小分子抑制剂提供了关键线索。
Extended Data Fig. 9: FB1限制了CerS6的构象柔性
Extended Data Fig. 10: FB1抑制CerS6催化循环示意图
四、发现FTY720可被CerS6 N-酰基化,揭示鞘氨醇类似物的代谢机制
FTY720是一种免疫抑制剂药物,结构类似鞘氨醇。有研究发现人体内FTY720可发生N-酰基化修饰,但究竟是由哪个酶催化的尚不清楚。作者发现,FTY720可以与CerS6的酰基化中间体反应,生成N-棕榈酰基FTY720(图3c):
To investigate whether purified CerS6 can N-acylate FTY720 in vitro, we incubated the enzyme with this compound and subsequently identi-fied C16:0 FTY720 in the reaction mixture (observed m/z: 546.4869; theoretical m/z: 546.4881; mass error: −2.20 ppm) (Fig. 3c), the expected product of a reaction between FTY720 and the CerS6-bound acyl chain.
作者进一步通过串联质谱(MS/MS)实验验证了这一N-酰基化FTY720产物的分子结构(Extended Data Fig. 6c,d)。
这一发现不仅解释了FTY720在人体代谢过程中发生N-酰基化修饰的机制,而且表明CerS可能广泛参与鞘氨醇类似物药物的体内代谢。这为研究此类药物的药代动力学行为提供了重要新思路。同时,研究人员在开发鞘氨醇类似物药物时,需要充分考虑其被CerS酶N-酰基化修饰的可能性及影响。
Extended Data Fig. 6c-d: 串联质谱验证N-棕榈酰基FTY720的分子结构
五、定点突变和分子模拟揭示了CerS6关键催化残基的作用机制
为更好地理解CerS6催化过程中各关键氨基酸残基的作用,作者进行了定点突变和酶活性测定实验(图3d,e):
Examining our structure, we noted the proximity of His212 to the acylated His211 in CerS6, suggesting that this residue is the hydrogen-bond acceptor. While the Nδ of His212 is located 3.84 Å away from the Nδ of His211, it is plausible that the two side chains interact in the acyl-CoA-bound state. Indeed, we found that substitution of His212 to alanine results in the complete loss of activity (Fig. 3e).
结果表明,His211与His212可能形成催化二联体,前者充当亲核试剂,后者作为氢键受体辅助其活化。此外,Asp242、Arg275、His238、Trp318等位点突变也显著影响了酶活性,提示其在底物结合、催化等过程中具有重要作用。
综合突变实验和结构信息,作者提出了一个CerS6催化反应的分子模型(图3d):酰基辅酶A的巯基首先被His211亲核进攻,形成高能量的四面体过渡态;过渡态羰基上的负电荷由Asn315稳定;然后硫酯键断裂,巯基离去,生成酰基-酶中间体;最后鞘氨醇的氨基对酰基进行亲核进攻,再生游离的酶,同时生成二氢神经酰胺产物。这一模型得到了分子动力学模拟的进一步支持。
这些机制研究加深了我们对CerS6催化过程中关键残基的作用理解,也为设计杂化转移反应的生物催化剂提供了新思路。此外,催化过渡态的构象信息,可指导基于结构的抑制剂虚拟筛选和优化。
小结
本文利用冷冻电镜解析了人CerS6酶及其与抑制剂FB1结合的复合物结构,发现了一个稳定的酰基-酶共价中间体,支持"ping-pong"催化机制。同时,FB1与酶反应生成一种N-酰基化衍生物,阐明了其抑制CerS6的分子机制。文章还发现CerS6可以催化免疫抑制剂药物FTY720的N-酰基化修饰。最后,定点突变和分子模拟进一步揭示了酶催化过程中关键残基的作用。总之,这些发现极大地丰富和深化了人们对CerS6结构与功能的认识,为开发针对CerS6的选择性小分子抑制剂奠定了坚实基础,有望为肥胖相关代谢性疾病的药物研发开辟新途径。
业界影响和应用前景
这项研究成果无疑将极大地推动CerS6相关药物的研发进程。基于论文揭示的CerS6结构信息和催化机制,制药公司可以:
开展基于结构的药物设计,有针对性地研发CerS6小分子抑制剂。文中解析的CerS6-FB1复合物结构可为此提供重要的结构基础和设计思路。
对现有抑制剂(如FB1)进行结构改造和优化,增强其选择性和成药性。深入理解抑制剂作用机制将有助于理性地改善分子的理化性质,提高口服利用度等。
利用高通量筛选和结构解析技术,发现新型CerS6抑制剂先导化合物。论文鉴定的CerS6关键氨基酸为评估先导化合物结合模式提供了重要参考。
从科研人员角度,未来可以考虑在以下方向深入研究:
CerS6催化反应动力学机制的研究,特别是利用新方法研究酶构象变化、底物结合/释放等快速动态过程。
CerS家族其他5个亚型的结构与功能的研究,阐明六个同工酶在底物选择性、组织表达谱等方面的差异。
CerS6与其他蛋白的相互作用网络研究,这将有助于揭示其在代谢网络中的调控机制。
CerS6在肥胖、糖尿病等疾病模型中的功能和调控机制研究,进一步论证其作为药物靶点的价值。
针对CerS6的先导化合物的构效关系和构象活性关系研究,指导后续抑制剂的优化。
进一步探索的科学问题
尽管这项研究取得了重大突破,但仍有许多问题值得继续探索,例如:
CerS6催化过程中构象动态变化的规律及其分子机制。目前的研究只获得了CerS6催化周期某一瞬间的静态结构,对其构象柔性及其与底物结合、催化反应的偶联机制仍不清楚。未来可利用单颗粒冷冻电镜、分子动力学模拟等方法深入研究这一问题。
CerS6的翻译后修饰(如磷酸化、糖基化)及其功能调控机制。目前对这些修饰如何影响CerS6活性、底物选择性、亚细胞定位等还知之甚少。这些修饰可能与代谢类疾病发生密切相关,有望成为新的药物干预靶点。
CerS6的组织特异性表达调控机制。不同组织中CerS6表达水平差异很大,这可能与不同组织脂质代谢的特点密切相关。深入研究其转录调控机制,有助于理解其生理病理功能。
CerS6抑制剂的 ADME 性质、脱靶效应及长期给药安全性。基于CerS6研发的创新药在临床前和临床阶段可能面临一些安全性和脱靶效应问题,需提前做好风险评估和药学研究。
CerS6在其他疾病中的作用及小分子调节剂的应用前景。除代谢类疾病外,CerS6与神经退行性病变等其他疾病也可能有关。这为CerS6抑制剂的应用拓宽了范围。
Critical Thinking
论文主要关注CerS6的结构和机制,对其他5种CerS同工酶的异同点关注较少。后续需要更多研究不同CerS亚型在结构、底物选择性等方面的差异,以指导选择性CerS6抑制剂的研发。
关于CerS6转录后修饰的讨论较少。考虑到这些修饰可能影响CerS6活性,后续需要更多实验来研究磷酸化、糖基化等修饰的作用和机制。
虽然论文通过定点突变初步研究了一些关键氨基酸残基的作用,但缺乏对所有保守位点的系统研究。后续可考虑结合计算模拟等手段,对突变体进行更全面系统的功能评估。
FB1与CerS6结合的动力学机制还不清楚。研究发现CerS催化形成的酰基化FB1产物仍结合在CerS6上。那么FB1是否也可在底物结合前直接结合酶并阻断底物进入仍需进一步研究。
尚未见 in vivo 神经酰胺水平检测结果。后续需要在相关疾病动物模型中,评估CerS6抑制剂对体内神经酰胺水平、组织中脂质组成的影响,进一步论证该靶点的价值。
CerS6突变体的结构研究将有助于更好地理解关键氨基酸的作用机制,但目前还没有突变体的结构。
Biosyn导师：David B. Sauer https://davidbsauer.com/
David B. Sauer博士是牛津大学诺菲尔德医学系药物发现中心的膜蛋白结构与化学生物学主要研究员。他拥有卓越的教育背景和丰富的科研经历。
Sauer博士于2005年在普渡大学获得化学学士学位,师从Jennifer Hovis教授。2012年,他在德克萨斯大学西南医学中心获得分子生物物理学博士学位,师从姜酉兴教授,博士论文研究钾离子选择性通道中的蛋白质结构和离子结合。
2012至2021年期间,Sauer博士在纽约大学医学院Skirball研究所从事博士后研究,师从Da-Neng Wang教授。在此之前,他曾在多个研究机构担任研究助理,包括德克萨斯大学西南医学中心生理学系(2006-2012)、普渡大学化学系(2003-2005)和密苏里大学圣路易斯分校化学系(2002)。
