论文的研究目标与意义
本文旨在研究CYP722A作为CYP722C的进化前体在独脚金内酯生物合成中的功能。独脚金内酯是一类重要的植物激素,既可以作为植物内部的发育信号,也可以作为植物与其他生物(如菌根真菌)进行根际信号交流的分子。其中,所谓非典型独脚金内酯主要发挥植物激素功能,而典型独脚金内酯则主要参与植物与其他生物的相互作用。理解独脚金内酯生物合成的进化历程,对于阐明植物如何通过化学物质与环境互作具有重要意义,也为通过代谢工程手段合成和改造独脚金内酯分子提供理论基础。
正如文章所说:
Canonical SLs have important roles in plant biotic interactions in angiosperms. However, the evolution of canonical SLs was not strictly necessary for the establishment of interorganismal communication in soil. Perhaps the adoption of SLs as hormones, greater chemical stability or mobility of canonical SLs in soil, or ongoing coevolution between plants and symbionts drove the division of noncanonical and canonical SLs into internal and external roles in flowering plants, respectively.
典型独脚金内酯在被子植物与其他生物的互作中发挥重要作用。但演化出典型独脚金内酯并非植物在土壤中建立生物间通讯所必需的。或许,将独脚金内酯用作激素、典型独脚金内酯在土壤中具有更高的化学稳定性或迁移能力,或植物与共生体之间不断的共同演化,驱使非典型和典型独脚金内酯在开花植物中分别发挥内部和外部作用。
论文提出的新思路与方法
过去对于CYP722A/B的功能知之甚少。本文创新性地构建了一个微生物共培养体系(microbial consortium),在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达了独脚金内酯生物合成的关键酶,实现了多种独脚金内酯前体和独脚金内酯分子的体外合成,从而能够研究酶催化反应的底物和产物。
We took advantage of a microbial consortium system for heterologous biosynthesis of SLs that we recently developed (Fig. 1B). In this system, a set of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae strains expressing plant SL biosynthetic enzymes are cocultured to produce a range of SLs and related molecules, including CL, CLA, ORO, 5DS, 18-OH-CLA, 4-deoxyorobanchol, and strigol.
研究者利用最近开发的一个用于独脚金内酯异源生物合成的微生物共培养系统(图1B)。在该系统中,一组表达植物SL生物合成酶的大肠杆菌和酿酒酵母菌株共培养,可生产一系列SLs及相关分子,包括CL、CLA、ORO、5DS、18-OH-CLA、4-脱氧列当醇和独脚金醇。
研究者通过代谢工程手段对共培养体系进行了一系列优化,使独脚金内酯(如5DS)的产量提高了120多倍。这使得可以获得足够量的独脚金内酯分子进行核磁共振(NMR)解析其化学结构。
CYP722A/B催化卡拉酮酸(CLA)生成16-羟基卡拉酮酸(16-OH-CLA)
研究者利用异源表达系统,鉴定了来自不同植物的16个CYP722A/B的功能。液相色谱-质谱(LC-MS)结果显示,当与CLA合成酶MAX1共表达时,所有CYP722A/B蛋白都能催化CLA转化为一个特征离子m/z为347.1的未知化合物,且保留时间(12.32 min)与已知的18-OH-CLA(12.54 min)不同(图1C)。
A new peak with a retention time (RT) of 12.32 min was detected by means of liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS) in all microbial consortia expressing CYP722A or CYP722B (ECL1/YSL2-5) (Fig. 1C and table S2). The peak had a negative mass/charge ratio (m/z) at 347.1, which is consistent with the mass of an oxidized CLA molecule (+16 Da).
通过制备足量的代谢产物并进行核磁共振(NMR)解析,研究者确定该未知化合物为16-羟基卡拉酮酸(16-OH-CLA)(图1F)。
图1
这一发现揭示了CYP722A/B的生理功能,即催化独脚金内酯(SL)生物合成的关键中间步骤。与之前认为CYP722是SL代谢的旁支不同,本研究证实其直接参与非典型SL的生成。这为理解SL在植物中的化学多样性奠定了分子基础。
16-OH-CLA和16-OH-MeCLA广泛存在于植物中
研究者系统分析了多种植物的代谢物,发现16-OH-CLA广泛存在于种子植物中。与其他SL不同,16-OH-CLA仅在植物地上部分检测到,在根部未检测到(图2A)。且其含量存在时空动态变化,如在杨树木质部,其含量随着春夏秋冬的季节更替而波动(图2C)。
16-OH-CLA was detected only in shoot tissues, which was not the case for CLA, MeCLA, or 1′-OH-MeCLA (Fig. 2A and figs. S12 and S13). Although other SLs have been found in shoots (as well as roots or root exudates), the shoot-specific localization of 16-OH-CLA is unusual (32).
图2
另外,16-OH-CLA可以被转运到植物地上部分。研究者给拟南芥根部喂养16-OH-CLA后,可以在地上部分检测到其存在,而直接喂养CLA则不能(fig. S15)。
进一步分析发现,16-OH-CLA的甲酯化产物16-OH-MeCLA也广泛存在于植物中,并与16-OH-CLA呈现相似的组织分布和动态变化规律(图5C,D)。
Similar to 16-OH-CLA, 16-OH-MeCLA was observed only in the shoot tissues of Col-0 and Atd14 plants but not the cyp722a mutants (Fig. 5C and figs. S10 and S12). 16-OH-MeCLA was also observed in poplar, pea, pepper, and N. nucifera, exhibiting a pattern of abundance during development that was similar to that of 16-OH-CLA (Fig. 5D and figs. S16 and S17)
这些结果表明,16-OH-CLA的生物合成和代谢普遍存在于植物界,这为其作为一种重要的内源信号分子提供了证据。这些发现颠覆了过去认为非典型SL仅局限于个别模式植物的观点,揭示了SL代谢的复杂性和多样性。
16-OH-CLA通过DWARF14(D14)受体激活独脚金内酯(SL)信号
研究者发现,外源喂养16-OH-CLA可以恢复拟南芥max3突变体的腋生分枝抑制表型,表明其具有SL的生物活性(图3A)。进一步实验表明,16-OH-CLA可以通过经典的SL受体DWARF14(D14)抑制下胚轴伸长(图3B),并诱导SL信号下游靶标SMAX1样蛋白SMXL7的降解(图3C)。
We found that 16-OH-CLA inhibited hypocotyl elongation in a manner that was dependent on the SL-receptor D14 (Fig. 3B). ... We observed that 16-OH-CLA induced degradation of the AtSMXL7 reporter in wild type but not the Nbd14a,b mutant (Fig. 3C).
图3
这些发现确立了16-OH-CLA作为一种新的内源SL激素的作用,丰富了人们对SL信号的认识。值得注意的是,尽管16-OH-CLA具有典型的SL活性,但其缺失并不引起拟南芥腋生分枝增多表型(图4),提示可能存在其他非典型SL的功能冗余。
图4
CLAMT和LBO参与16-OH-CLA的代谢和生物活性
研究者在微生物体系中证实,卡拉酮酸甲基转移酶(CLAMT)可以将16-OH-CLA甲酯化生成16-OH-MeCLA,而侧生分支氧化还原酶(LBO)可以进一步转化16-OH-MeCLA,产生一个未知的下游代谢产物(图5B)。有趣的是,16-OH-CLA在拟南芥幼苗中抑制下胚轴伸长的活性依赖于CLAMT和LBO基因(图5A),提示16-OH-MeCLA及其衍生物可能是更直接的SL信号分子。
We examined whether 16-OH-CLA can be consumed by CLAMT and LBO. ... A peak likely to be 1′-OH-MeCLA (RT at 14.13 min, positive ion at m/z 363.1) was detected in both ECL12/YSL62 and ECL12/YSL66 (figs. S23 and S24). There also was a decrease in the abundance of 16-OH-MeCLA in ECL12/YSL66 in comparison with ECL12/YSL65 (fig. S24 and table S2), which might be due to LBO shunting CLA metabolism to 1′-OH-MeCLA or the conversion of 16-OH-MeCLA by LBO to a downstream product.
Hypocotyl elongation of clamt and lbo seedlings was not significantly affected by 16-OH-CLA treatment (Fig. 5A), implying that both genes are required for 16-OH-CLA bioactivity.
图5
另一方面,在缺失CYP722A基因时,CLA可能会通过CLAMT和LBO途径转化为MeCLA和1′-OH-MeCLA等SL分子,从而维持正常的腋生分枝数(图5E)。
One interpretation of these results is that CYP722A has no role in shoot branching regulation for A. thaliana, at least under our nutrient-replete growth conditions. Alternatively, it may be that its product, 16-OH-CLA, is metabolized further by CLAMT and LBO into a branching regulator. In the absence of CYP722A, a metabolic shunt to CLA instead of 16-OH-CLA as a CLAMT substrate might produce SLs sufficient to maintain normal branching.
这些结果揭示了16-OH-CLA代谢的复杂性,提示非典型SL的生物活性可能由一系列代谢衍生物协同介导。CLAMT和LBO不仅参与16-OH-CLA代谢,而且可能在CYP722A缺失时提供代偿性合成途径,生成其他SL分子,从而维持正常的生理功能。这一发现为深入解析非典型SL的代谢调控网络指明了方向。
CYP722酶活性位点的定向进化塑造了典型独脚金内酯的生物合成
研究者通过同源模建和对接分析,鉴定了CYP722A与CYP722C活性位点的关键氨基酸残基差异。令人惊讶的是,当把CYP722A第465位的苯丙氨酸(F)突变为异亮氨酸(I)时,CYP722A即可获得催化CLA生成18-OH-CLA(典型SL前体)的能力(图5F)。
We used structural models to identify candidate residues that differentiate the activities of CYP722A and CYP722C on CLA. A single amino acid change in the active site of CYP722A proteins gains production of 18-OH-CLA, an intermediate in canonical strigolactone formation by CYP722C.
这一发现提示,CYP722C很可能是通过CYP722A/B的基因重复和新功能化而进化产生的。仅需单个氨基酸突变即可使CYP722A获得催化CLA C-18羟化的能力,生成18-OH-CLA,进而导向典型SL的合成。该结果揭示了酶活性位点残基在SL结构多样性进化中的关键作用,也为后续通过定向进化和代谢工程创造新的SL衍生物奠定了基础。
论文的核心发现总结
本文运用遗传学、生物化学和代谢组学等多种研究手段,系统阐明了CYP722酶在独脚金内酯(SL)生物合成进化中的关键作用。研究发现,广泛存在于种子植物中的CYP722A/B酶催化卡拉酮酸(CLA)生成16-羟基卡拉酮酸(16-OH-CLA),后者可进一步转化为一系列具有SL活性的下游代谢产物,参与调控植物的生长发育。而在被子植物进化过程中,CYP722A/B的基因重复和新功能化导致了CYP722C的产生,使之获得了催化CLA C-18羟化的能力,由此引发了典型SL的生物合成。
研究成果的意义与启示
通过系统发育分析,研究者提出CYP722C是通过基因重复和新功能化从CYP722A进化而来的。有趣的是,当把CYP722A活性位点的一个关键氨基酸残基F465突变为CYP722C中的异亮氨酸(I)时,CYP722A即获得了催化CLA生成18-OH-CLA的能力(18-OH-CLA是生成典型独脚金内酯如ORO和5DS的前体)(图5F)。这一发现揭示了CYP722酶活性位点的精巧进化。
该研究从进化的视角,阐明了独脚金内酯作为一类复杂分子在植物中的化学多样性和功能分化。一方面,CYP722A催化生成的16-OH-CLA可能代表了独脚金内酯早期的进化状态,主要作为植物内源激素参与调控植物生长发育。另一方面,CYP722C的出现标志着典型独脚金内酯的出现,使得植物获得了通过独脚金内酯与其他生物进行根际信号交流的能力。
研究者指出,构建的微生物共培养系统可以通过代谢工程手段高通量合成多种独脚金内酯及前体分子,为植物化学生态学研究提供物质基础。而CYP722酶的晶体结构和催化机制的阐明,也可能为定向进化和合成具有特定生物活性的独脚金内酯衍生物奠定基础。
进一步探索的方向与机遇
研究结果引发了一些值得进一步探索的科学问题:
16-OH-CLA仅在植物茎尖组织积累,并随发育阶段动态变化,这种时空特异性分布对其生理功能有何暗示? 16-OH-CLA及其衍生的16-OH-MeCLA等分子在植物体内的代谢命运如何?它们是否参与未知的信号通路? 除了CYP722C,植物中是否存在其他酶参与典型独脚金内酯的多样性合成?不同结构的独脚金内酯在生物互作中是否具有特异性的生态功能? 能否构建以CYP722酶、CLAMT和LBO等为元件的独脚金内酯合成的代谢工程菌株,从而大规模制备和定向改造天然和非天然的独脚金内酯分子?
Biosyn导师：李嫣然
Yanran Li是加州大学圣地亚哥分校(UC San Diego)雅各布斯工程学院化学与纳米工程系Aiiso Yufeng Li家族化学与纳米工程系的副教授。她的研究领域涵盖合成生物学、代谢工程、植物代谢和化学生物学。
Li教授的团队致力于利用工程技术,融合化学和生物学的方法来研究植物。他们专注于创建微生物细胞工厂,以深入洞察植物的代谢和免疫机制。其目标是培育更加健壮的植物,使其能够更好地应对从病虫害到环境条件变化和气候变迁等一系列挑战。
在加入UC San Diego之前,Li教授于2016年至2023年期间在加州大学河滨分校(UC Riverside)化学与环境工程系担任助理教授。她于2007年在南开大学获得化学学士学位,同年在天津大学获得化学工程学士学位。2012年,她在加州大学洛杉矶分校(UCLA)完成了博士学位,随后在加州理工学院(Caltech)进行了一年的博士后训练,并于2013年至2016年在斯坦福大学继续从事博士后研究。Li教授的出色工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)主任新创新者奖和美国国家科学基金会(NSF)职业奖的认可。
