Nature最新| 分子水平解析非核糖体肽组装的时空协同机制

论文的研究目标和意义

本论文于2024年12月11日在线发表于Nature。研究目标是通过交联和冷冻电镜技术,高分辨率解析非核糖体肽合成酶(NRPSs)中两个肽载体蛋白(PCPs)与缩合结构域(C domain)的相互作用。NRPSs是一类用于合成重要治疗性药物(如抗生素、免疫抑制剂等)的关键酶。它们利用PCPs将底物穿梭于各催化步骤,但由于其多结构域和多模块的动态特性,一直难以进行结构表征。如文中所述:

Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are carrier proteindependent assembly lines that are used for producing essential therapeutic drugs, including antibiotics, immunosuppressants, antivirals and chemotherapeutics1. Large multi-domain and multi-modular proteins, NRPSs use peptidyl carrier proteins (PCPs) to shuttle substrates through the modular process of peptide synthesis2.

解析NRPS的分子结构细节,对于理解这类独特合成酶的催化机制、指导后续的合成生物学设计至关重要。因此,该研究对于开发新型NRPS衍生药物、优化生物合成路线等具有重要意义。

研究思路与方法创新

为了捕获瞬时的PCP-C相互作用,本研究创新性地引入了四嗪点击化学(tetrazine click chemistry)进行PCP交联。研究人员设计合成了一系列含反式环辛烯(TCO)和四嗪基团的泛酰巯基乙胺衍生物作为交联探针(probes 1S/2S, 1L/2L),通过与PCP的保守丝氨酸残基特异性结合,在C结构域的通道内实现两个PCP的快速点击连接(图1d-e)。相比传统的非特异性交联剂,该方法可以捕获具有生物学意义的蛋白质构象,减少构象异质性。

之后作者利用冷冻电镜技术对三种不同交联产物(complexes A-C)进行了结构解析,分辨率达到2.97-3.31 Å(图2,扩展图4),实现了对PCP-C-PCP三元复合物的高分辨率成像。相比之前依赖X射线晶体学的研究,cryo-EM可以更好地应对NRPS这类高度柔性的大分子机器。

综上,作者将两种前沿技术(四嗪点击化学和cryo-EM)巧妙结合,克服了以往研究的技术瓶颈,为深入理解NRPS的结构基础提供了全新视角。正如文中总结:

The potential to constrain dynamic movement through dual site-selective crosslinking establishes a viable alternative to non-selective crosslinking agents by decreasing the number of possible low-energy states. Combined with the power of cryo-EM, this workflow provides a robust system for characterization of the molecular details of large megasynthetases.

交联捕获与冷冻电镜揭示非核糖体肽合成酶中载体蛋白与催化结构域的相互作用机制

交联-冷冻电镜技术捕获PCP在NRPS催化循环中的动态传递

本文的一个核心发现是通过创新性地将四嗪点击化学与冷冻电镜相结合,高分辨率地解析了肽载体蛋白(PCPs)在非核糖体肽合成酶(NRPSs)催化过程中与不同结构域(尤其是缩合结构域C)的相互作用。这一技术突破攻克了PCP在多模块NRPS装配线中动态穿梭这一科学难题。 如图1所示:

Fig. 1: Crosslinking captures the PCP1-C2-PCP2 interaction using TCO-Tz click chemistry

作者设计合成了一系列四嗪/环辛烯功能化的PCP交联探针(1S/2S, 1L/2L),实现了PCP在C结构域两端的特异性共价连接。

We applied the fast trans-cyclooctene-tetrazine (TCO-Tz)-based click reaction20,21 to synthesize trans-cyclooctene-pantethenamide (1S and 1L) and tetrazine-pantethenamide (2S and 2L) crosslinkers (Extended Data Fig. 1a).

通过优化探针的结构与反应条件,作者筛选出3种高效的PCP-PCP交联组合(complexes A-C),为后续的结构研究奠定了基础(扩展图1,2)。

Eight reactions were screened by SDS–PAGE using combinations of 1S, 1L, 2S and 2L (Extended Data Fig. 1). As an example, probe 1L and 2S were first chemoenzymatically converted to their coenzyme A analogues 1L CoA and 2S CoA (step 1 in Extended Data Fig. 1b)...On completion, the proteins were prepared for crosslinking by buffer exchange and concentration. Crosslinking (step 3, Extended Data Fig. 1b) was conducted by incubating crypto-TycA-M1 with crypto-TycB-M2 at 30 °C in 1:1 stoichiometry with cofactors and substrates. Using SDS–PAGE (Extended Data Fig. 2a), we observed crosslinking with yields of 40–60%.

随后,作者利用冷冻电镜技术对这3种交联复合物进行了高分辨率的结构解析(分辨率2.97-3.31 Å),获得了PCP与C结构域相互作用的精细结构信息(图2)。 这是首次在近原子分辨率下直接观测到完整的PCP-C-PCP复合物结构。

Fig. 2: Cryo-EM structures of crosslinked TycA-M1-TycB-M2 complexes A-C

这些结构清晰展示了PCP与C结构域疏水接触面上的关键残基(如PCP1-S563, C2-S282/N358)介导的极性相互作用(图5),揭示了PCP在C结构域催化通道两端的精确对接方式。

The interface of the PCP with the C domain is predominantly hydrophobic; the PCP 1 donor side interactions are localized between helices 8 and 9 of the C2 domain, with a total buried area of 551 Å 2. There are polar contacts between the C2 domain and the 4′-phosphopantetheine (PPant) of the crosslinker, where S255 forms a hydrogen bond to the phosphate, and S282 and N358 form additional hydrogen bonds to the PPant amide (Fig. 5b).

并通过与之前获得的PCP1-E1复合物晶体结构(扩展图5)的比对,首次在分子水平上勾勒出了完整的PCP在NRPS催化循环中的动态轨迹。

COM结构域参与PCP的跨模块招募

另一个重要发现是阐明了COM结构域在介导PCP跨模块识别与成组装中的新功能。过去对COM结构域的认识主要局限于其在NRPS终端模块中的"闭合触发"作用。而本文的交联结构首次在分子水平揭示了COM结构域可以通过与下游模块的PCP结合,在催化循环的延伸阶段实现PCP的特异性募集(图4):

Fig. 4: COM domain interacts with the downstream PCP and facilitates its recruitment

这种PCP2-COM相互作用主要通过以下位点实现:

1. COM螺旋的疏水面与C2结构域的β折叠形成疏水接触(图4b,d)
2. COM螺旋的两个带电残基(D1078/E1075)与PCP2 螺旋2的K1019形成盐桥(图4b,c)
3. COM结构域的环区与C2结构域及PCP2形成多个极性相互作用(如R1061-C2,K1069-C2,Q1018-C2)(图4b,e)

Most of the interactions are hydrophobic along the front face of the COM helix and the outer face of the antiparallel β-sheets (Fig. 4b–d) that comprise the COM hand motif. The polar outer side of the COM helix has further interactions with TycB-M2 from both sides, including K6 of the COM hand and K1019 of the PCP 2 domain.

作者通过定点突变实验进一步验证了这些关键残基突变(尤其是盐桥消除)会显著降低NRPS的催化活性(图4h),支持了COM-PCP相互作用在催化装配中的重要作用。

The K1019A mutation reduced activity by 35%, and charge-swapping lysine 1019 to glutamate (K1019E) resulted in a 60% loss of activity. These indicate that the C terminus of PCP 2 helix 2 interacts with the COM helix, and disruption of these interactions has a strong deleterious effect on the throughput of the pathway.

综上,这些结果揭示了COM结构域一种新的互补功能,即通过与下游PCP的相互作用提高组装的时空特异性,对于理解NPRS的高效、定向合成具有重要意义。

腺苷酰化结构域的构象动态与底物结合

本文还观察到腺苷酰化(A)结构域在催化循环不同阶段的动态变化。 通过比较3种交联复合物,作者发现A结构域的构象与底物结合状态密切相关(图3):

Fig 3: Conformational dynamics of the adenylation domain and its substrate binding states

We visualized the effect of A domain loading on the trapped complexes, where each showed a different state (Fig. 3d,e). Complex C contained no density for AMP or ATP. The map for complex B contained AMP (Fig. 3e and Supplementary Fig. 4c)...Supplemented with l-Pro, Mg 2+ and ATP, complex A shows TycB-M2 could prepare and bind the AMP-activated ester of l-Pro (l-Pro-AMP) from l-Pro and ATP as the first A domain half-reaction.

当A结构域空载时,其与C/PCP结构域的相互作用最少(complex C);当其结合AMP时,与C结构域的接触增加(complex B); 当完全结合L-Pro-AMP时,构象进一步闭合(complex A),有利于下一轮催化的进行(图3d,e)。值得注意的是,A-C结构域间的动态接触并不显著影响PCP在C结构域上的结合构象。

This indicates that A 2 domain loading does not alter the ability of the two PCPs to deliver their cargo into the C 2 domain tunnel.

这提示NRPS可以通过调控A结构域的构象实现催化步骤的精细协调,在延伸反应的同时启动下一轮底物的腺苷酰化,从而提高了总体催化效率。这一发现为理解NRPS协同催化机制提供了新的视角。

E结构域与PCP结合的晶体结构揭示了立体选择性控制

除了PCP与C结构域的交联研究外,作者还利用硫酸盐探针捕获了E结构域与PCP的相互作用,并解析了其晶体结构(扩展图5):

Extended Data Fig. 5: Crystal structure of the crosslinked PCP1-E1 didomain

We recently developed a crosslinking probe to trap PCP and E domain interactions in TycA based on a phenylsulfonate31. Using the E882A TycA-M1 E 1 domain active-site mutant, the C5-phenylsulfonyl pantethenamide efficiently formed an intramolecular PCP–E crosslinked species that crystallized in MES buffer at pH 7.1 with 1.8 M ammonium sulfate. X-ray diffraction and molecular replacement using the PCP E domain from GrsA6 led to a TycA PCP 1 –E 1 crosslinked structure at 2.12 Å

晶体结构清晰展示了PCP上的PPant臂与E结构域活性位点(H743)形成共价交联,揭示了PCP在E结构域表面的特异性结合方式(扩展图5c)。 更重要的是,将PCP1-E1结构与PCP1-C2-PCP2结构进行叠合,可以直观地示踪PCP在两种结构域间的构象转换(扩展图5d,e):

Overlays with crosslinked TycA-M1–TycB-M2 demonstrate how the PCP may relay between the E 1 and C 2 domains (Extended Data Fig. 5d,e). This transition transforms the epimerization process from an equilibrium state to a unidirectional flow of metabolites with stereoisomeric fidelity. This exchange, which requires the PCP to rotate 180° and the PPant to undergo a 45-Å movement

可以看到,PCP需要经历显著的空间位移(~45 Å)和旋转(~180°),才能在保证立体选择性的同时将底物高效传递到下游催化位点。这一构象变化在多肽合成的手性控制中起着至关重要的作用。

关键催化残基的突变验证

为了进一步验证结构生物学研究得到的关键催化位点,作者对PCP-C交联复合物中的多个关键残基进行了定点突变,并通过双酮哌嗪(DKP)形成实验评估了它们对NRPS整体催化活性的影响(图4h):

To evaluate the importance of salt bridges, we prepared E1075Q and D1078N. E1075Q exhibited little loss of activity (88% remain ing) and D1078N exhibited activity similar to the wild type, indicating that formation of a hydrogen bond with K1019 is sufficient to retain wild-type activity. We combined these COM helix mutations (E1075Q and D1078N) with K1019E on TycB-M2 to determine whether there is a cumulative effect on activity. E1075Q/K1019E and D1078N/K1019E exhibited 56% and 38% reduced activity, respectively (Fig. 4h).

结果表明,PCP2与COM间的盐桥互作(D1078-K1019)以及COM与C2结构域的极性相互作用(D11,E357)对于维持NRPS的催化效率至关重要,为靶向调控NRPS活性提供了新的位点。同时,这些突变数据与结构解析相互印证,进一步支持了本研究得到的 PCP/COM/C 相互作用模型的可靠性。

小结:本文基于创新性的交联-冷冻电镜研究策略,在前所未有的分辨率下解析了 NRPS 装配线中 PCP 与多个催化结构域的动态互作模式。研究不仅实现了对 PCP 在 NRPS 催化循环中"感知-结合-传递"过程的直接成像,还发现了 COM 结构域在跨模块 PCP 募集中的新功能,以及 A/E 结构域构象变化与 PCP 传递的偶联机制等。 这些发现极大地丰富了我们对 NRPS 分子机器精细调控的认知,为后续的机理研究、定向进化和生物合成应用奠定了重要结构基础。

研究成果的影响与启示

本研究通过交联-cryo-EM工作流,在分子水平上解析了NRPS多模块、多结构域蛋白的动态组装过程,展现了PCP在肽链延伸过程中的精细调控机制。这些发现具有重要的学术和应用价值:

1. 揭示PCP与各结构域(C/A/E)在不同催化阶段的特异性相互作用模式,加深了对NRPS结构与功能的理解,为后续的机理研究和结构指导的酶工程提供了重要参考。
2. 阐明COM结构域在介导PCP募集和跨模块识别中的新功能,拓展了对NRPS高效合成高分子肽的分子基础的认识。这为通过定向进化优化NRPS催化效率提供了新思路。
3. 建立了一套原创性的交联-cryo-EM技术体系,可以推广应用到其他 NRPSs和 PKSs (聚酮合成酶)等难以结晶的大分子装配线的结构研究中。这将极大促进合成生物学、天然产物开发等领域的技术进步。
4. 高分辨率的结构信息有助于解析NRPS 催化机制中悬而未决的问题,加速基于结构的底物选择性和催化効率的定向改造,为工程化、组合化生物合成提供理论基础,推动新型 NRPS 衍生药物的开发。

未来研究方向与挑战

尽管本研究在解析 NRPS 的结构基础方面取得了重要进展,但仍有许多问题有待进一步探索:

1. 本研究只解析了 NRPS 催化循环中的某些瞬时状态,要全面理解 PCP 在整个装配线中的动态转移过程,还需要捕获更多中间态,提高时间分辨率。这可能需要开发新的探针分子和搭建更复杂的体外重构体系。
2. 本研究主要关注 PCP 与 C/A/E 结构域的相互作用,对于其他重要结构域如 MT (甲基转移酶)、 Cy (环化酶)等的调控机制还知之甚少。未来需要进一步扩展交联策略,系统解析 PCP 在更多催化步骤中的作用。
3. COM 结构域介导的跨模块、跨蛋白质的 PCP 募集机制还有待深入研究。需要更多的结构生物学和动力学模拟研究来阐明 COM 结构域的分子识别机制和构象变化规律。这可能催生出新的基于 COM 工程的定向进化技术。
4. NRPS 装配线的时空调控、底物流动、产物释放等过程的分子机制还不清楚。整合多种原位检测技术(如荧光标记、化学探针等),实现 NRPS 合成过程的实时成像和动态示踪将是一个重要方向。
5. 不同 NRPS 体系在结构域组成、底物选择性等方面差异很大。本研究建立的技术体系能否推广到其他类型 NRPS 的结构解析还有待进一步验证。克服体系移植和优化过程中的挑战,建立更加通用、高通量的研究范式是一个必然要求。

Critical Thinking

1. 本研究使用的四嗪点击交联产物与天然 NRPS 底物在化学结构上存在差异,可能会在一定程度上影响 PCP 与 C 结构域的相互作用方式。未来需要开发化学性质更接近天然底物的交联探针,以提高结构解析的生物学相关性。
2. 本研究主要采用体外重构的方式来研究 PCP 与其他结构域的相互作用,这与体内的生理环境(如分子拥挤效应、离子强度等)还有一定差距。后续研究需要发展原位捕获策略,实现对 NRPS 装配线的动态解析。
3. 本研究虽然获得了 PCP-C-PCP 复合物的高分辨率结构,但对于 PCP 在两种构象间的动力学转换过程还缺乏直接的实验证据。需要引入更多的结构生物学技术(如 cryo-ET、XFELs 等),实现对 NRPS 催化过程的多尺度、动态表征。
4. 作为 NRPS 研究的开创性工作,本文提出的交联-cryo-EM 策略在其他 NRPS 体系中的适用性还有待系统评估。克服底物特异性、样品制备难度等瓶颈,建立标准化、高通量的研究流程,将是一个巨大的技术挑战。

Biosyn导师：Michael D. Burkart

https://www-chem.ucsd.edu/faculty/profiles/burkart_michael_d.html

Michael D. Burkart是加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系的正教授,同时也是加州藻类生物技术中心的副主任。他于1994年在莱斯大学获得化学学士学位,1999年在斯克里普斯研究所获得有机化学博士学位。之后他在哈佛医学院完成了博士后研究(2000-2002)。

Burkart教授的主要研究方向包括:

1. 生物合成的化学和结构生物学,重点研究脂肪酸合酶、聚酮合酶和非核糖体肽合成酶等模块化代谢途径。他的实验室利用NMR、X射线晶体学和cryo-EM等技术来阐明这些途径的催化机制和蛋白质相互作用。
2. 利用藻类开发可再生和可生物降解的燃料及材料。他们从藻类生物质中提取单体制备了可完全生物降解的聚氨酯泡沫材料,为解决难降解塑料污染问题提供了新思路。相关研究成果已经在其创办的Algenesis Materials公司实现商业化生产。
3. 抗肿瘤和抗感染药物的发现与开发。他们开发了剪接体调控剂和蛋白水解靶向嵌合物(PROTAC)等先导化合物。其中Rebecsinib是迄今为止最强效的抗癌剪接体抑制剂,即将通过Aspera Biomedicines公司申请新药临床试验。

此外,Burkart教授还致力于多项学术外展与科普活动,如共同创建天然产物亲和力小组(NPAG)、加州藻类生物技术中心(Cal-CAB)等,积极促进科研成果的推广应用。

他曾获得多项荣誉与奖励,包括美国科学促进会会士(2017)、英国皇家化学会会士(2015)、斯隆研究奖金(2007)等。目前,他担任加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系主任。