综述的主要目的和意义
本文的主要目的是系统总结真菌大环内酯化合物酯键形成的多样性策略,重点关注参与酯键形成的酶(硫酯酶结构域和缩合结构域)的作用机制,并讨论这些酶在化学酶法合成大环内酯骨架方面的应用潜力。
正如作者所指出的那样,尽管前人已经从各个角度总结了真菌大环内酯的合成途径、来源、分离和生物活性,但是对酯键形成策略及其机制的综合讨论尚属空白:
A comprehensive discussion regarding the synthetic strategies and the mechanism in the formation of ester bonds in fungal macrolides has not yet been conducted. To bridge this gap, this review focuses on these two aspects as well as the chemoenzymatic application of discovering lactonization enzymes/domains.
可见,在大量研究成果的基础上,有必要在分子水平上澄清真菌大环内酯骨架构建的化学逻辑,这对于发现新的生物活性大环内酯具有重要意义。
对该领域发展历程的回顾与梳理
作者主要从大环内酯的生物合成起源对该领域的发展历程进行了梳理,并根据参与酯键形成的酶类型将其分为三个阶段:
- 聚酮型大环内酯
:由硫酯酶结构域引入酯键
如tetrahydropyrenophorol、sch-642305、brefeldin A 等
间苯二酸内酯(RAL):如玉米赤霉烯酮、hypothemycin、radicicol等 二羟基苯乙酸内酯(DAL):如10,11-脱氢曲古抑菌素
顺式作用硫酯酶结构域催化的大环内酯化反应 反式作用硫酯酶催化的大环内酯化反应
如bassianolide、enniatin B等环寡聚缩肽类化合物 迭代型缩合结构域引入多个酯键,如fusarinine C
如destruxin类化合物、leualacin等
由含单模块NRPS催化:如thermolide类化合物 由含多模块NRPS催化:如emericellamide A、fusaristatin A等
末端缩合结构域催化的大环内酯化反应 缩合结构域催化的酯化反应 迭代型缩合结构域催化的大环内酯化反应
以上分类体现了真菌大环内酯酯键形成策略的多样性。随着基因簇的发掘和生物合成机制的阐明,人们对这一过程的认识不断深入。
阐明真菌大环内酯酯键形成的两大关键酶催化机制
综述在分析该领域研究现状时指出,硫酯酶结构域(TE) 和缩合结构域(C) 通过不同的催化机制在真菌聚酮型、非核糖体肽型和聚酮-非核糖体肽杂合型大环内酯的生物合成中引入酯键,形成大环内酯骨架:
In the examples mentioned above, two key enzyme families, the TE and C domains, play essential roles in macrolide biosynthesis, making them ideal candidates for chemoenzymatic synthesis.
作者进一步指出,尽管TE和C结构域的催化机制相似,但在羟基来源、酯键形成时机和酶结构域位置等方面存在显著差异。
对于TE参与的聚酮型大环内酯生物合成:
In TE-catalysed macrolides, the hydroxyl group used for esterification is synthesized by PKS during chain elongation. TE transfers the polyketide chain from ACP to itself and then catalyses ester bond formation to generate a macrolide skeleton in the release step.
而C参与的非核糖体肽型或杂合型大环内酯的生物合成中:
In contrast, the C domain is an internal component of NRPS, and it does not function as a separate enzyme, such as trans-acting TE. Specifically, the location of the C domain is flexible; it is located at the C-terminal of NRPS as the CT domain and is suited to the N-terminal or the middle region of NRPS. In C domain-catalysed macrolides, the hydroxyl group utilized for esterification originates from the α-hydroxy acid or polyketide chain, leading to the formation of NRP-type or PK–NRP hybrid-type macrolides, respectively. The hydroxyl group of the polyketide chain is generated by KR domain-catalysed reduction during the PKS assembly line. However, the hydroxyl group of α- hydroxy acid is reduced from α-keto acid by a standalone KR during the off-line process. C domain directly catalyses the esterification of α-hydroxy acid or polyketide chain loaded onto the T domain, without transferring them to itself to form ester bonds during the chain elongation or termination process.
阐明TE和C结构域在不同类型真菌大环内酯生物合成中引入酯键的催化机制,揭示了大环内酯酯键多样性形成的分子基础。这一新认识打破了人们对大环内酯酯键来源单一、形成模式雷同的旧有认识,极大拓宽了人们对大环内酯结构多样性的认知。
揭示顺式作用TE结构域催化大环内酯化的两大关键因素
对于由HRPKS和NRPKS协同合成的苯二酚型(如间苯二酸内酯RAL和二羟基苯乙酸内酯DAL)大环内酯,作者通过分析AtCURS1–AtCURS2、AzRESS1–AzRESS2和CcRADS1–CcRADS2对的组合生物合成(图8),发现影响NRPKS末端顺式作用TE结构域催化大环内酯化的两大关键因素:HRPKS组装的酰基链长度和NRPKS-PT结构域催化的区域选择性aldol缩合。
HRPKS组装的酰基链长度决定内酯环大小
Compared with their native roles, changing the HRPKS-assembled acyl chain from C8 length to C10 length results in the yield of macrolides with larger lactone rings. ... In contrast, shortening the HRPKS-assembled acyl chain from C10 length to C8 length leads to no production of macrolides.
如图8(B)所示,当AtCURS1替换为CcRADS1时,AtCURS2的TE结构域催化生成了14元而非12元的大环内酯radilarin;当CcRADS1配对AzRESS2时,则产生另一14元大环内酯monocillin II,而非12元的trans-resorcylide。相反,当CcRADS1改为AzRESS1时,AzRESS1–CcRADS2对虽可形成CcRADS2的八酮基底物,但TE结构域不能催化大环内酯化。这表明在HRPKS-NRPKS混合体系中,TE结构域对于更长的酰基链底物容忍度更高,可形成尺寸更大的内酯环。
图8
NRPKS的PT结构域催化aldol缩合模式决定大环内酯生成
The aldol condensation register, catalysed by the PT domain of NRPKS, represents another critical factor in macrolide formation. The alternation of aldol condensation registers leads to no production of macrolides.
图8(C)显示,将CcRADS2-PT替换成AtCURS2-PT(C2-C7到C8-C3缩合模式切换)的CcRADS1–CcRADS2-PT<sub>AtCURS2</sub>对产生了8元内酯,而非14元内酯monocillin II。反之,将AtCURS2-PT替换成CcRADS2-PT(C8-C3到C2-C7)的AtCURS1–AtCURS2-PT<sub>CcRADS2</sub>对生成异香豆素类化合物,而不是大环内酯。甚至在AtCURS2-PT的3个关键氨基酸残基发生点突变、切换缩合模式但不影响与TE相互作用时,AtCURS1–AtCURS2-PT<sub>mutation</sub>的大环内酯生成也被抑制。可见,PT催化的aldol缩合模式对TE结构域催化的产物释放方式至关重要。
HRPKS组装的酰基链长度和NRPKS-PT催化的aldol缩合模式是影响NRPKS顺式作用TE结构域催化大环内酯化的两大决定因素,分别决定了内酯环尺寸和能否形成大环内酯。这一重要发现首次从分子机制上解释了一类大环内酯结构多样性形成的关键,为未来工程改造生物合成途径、创制新颖大环内酯奠定了重要基础。
揭示C和CT结构域引入多重酯键的分子机制
综述还重点分析了由C和CT结构域引入多重酯键的环寡聚缩肽类大环内酯,如由2个模块的NRPS BbBSLS催化的bassianolide生物合成(图17)。
图17
作者指出,此类大环内酯生物合成过程中涉及C和CT结构域的迭代使用:
In addition, both the C and CT domains can be iteratively utilized to introduce multiple ester bonds into the macrolide skeleton.
如bassianolide (图17A):
In the biosynthesis of 12, the C1 domain is inactive, and the other domains are iteratively utilized. Specifically, the first substrate D-Hiv, derived from 2-ketoisovalerate acid via the NADPH-dependent reduction, is recognized and transferred from the A1 domain to the T1 domain. However, the A2 domain activates and transfers L-Leu to the T2a/b domain, and the MT2 domain then catalyses N-methylation. The C2 domain is responsible for the condensation between hydroxyisovalyl-T1 and aminoacyl-T2a/b via amide bond linkage, yielding a T2a/b-bound dipeptidyl monomer. In the following step, the CT domain catalyses the ester bond formation between dipeptidyl-T2a/b and another hydroxyisovalyl-T1, thereby leading to the generation of a tridepsipeptidyl intermediate loaded to the T1 domain. This process occurs iteratively to construct a linear octadepsipeptide chain that is cyclized by the CT domain to form the macrolide 12.
类似地,fusarinine C (图18)的生物合成也涉及C和CT结构域对酯键的迭代引入:
In the whole process, the C domain iteratively catalyses esterification to introduce two ester bonds, and CT introduces the third ester bond, highlighting the unique assembly pathway in NRP biosynthesis.
上述分析揭示了C和CT结构域在环寡聚缩肽类大环内酯中引入多重酯键的分子机制。这一重要认识拓展了人们对NRPS途径产物结构多样性的理解,为利用基因簇挖掘新型环寡聚缩肽化合物提供了新思路。同时,这也为应用C结构域进行结构复杂的大环内酯化合物的化学酶合成提供了分子工具。
图18
结语
本文系统综述了真菌大环内酯酯键形成的生物合成策略,重点阐释了TE和C结构域在不同类型大环内酯(PK、NRP和PK-NRP杂合型)中的催化机制异同,揭示了一系列影响TE结构域催化大环内酯化的关键因素(酰基链长度和PT催化的aldol缩合模式)以及C和CT结构域引入多重酯键的分子机制。这些重要认识极大拓展了人们对真菌大环内酯结构多样性形成机制的理解,为创制结构新颖的大环内酯类化合物提供了理论基础和分子工具,也为相关生物合成基因簇的发掘和组合生物合成奠定了基础。可以预见,随着大环内酯生物合成机制研究的不断深入,酯键形成相关酶的结构解析和催化机制研究,将为创制结构多样的大环内酯天然产物开辟新的途径,推动药物研发等领域的发展。
对未来趋势的预测与展望
作者认为,尽管人们对酯键形成策略的认识已经大大深入,但仍有许多问题有待阐明:
Although our understanding of ester bond formation strategies in fungal macrolides has advanced with genomic sequencing, the discovery of biosynthetic pathways, and the acquisition of crystal structures, many mysteries still need to be resolved.
例如含有多个酯键的大环内酯如trichobotryside A、macrosphelide A、bartanol等的生物合成机制尚不清楚。此外,倍半萜-大环内酯杂合物(如三萜烯类大环内酯)代表了一类新颖的真菌大环内酯,其生物合成可能涉及到萜烯环化酶与PKS的协同作用,但具体途径仍有待研究。
综述强调,阐明真菌大环内酯酯键形成的策略对于在化学酶合成中应用这些酶或结构域、创制结构新颖的大环内酯具有重要价值:
The elucidation of ester bond formation strategies in fungal macrolides presents valuable opportunities for applying these enzymes or domains in chemoenzymatic synthesis. Utilizing TE or C domains as biocatalysts represents an innovative approach for synthesizing macrolide skeletons with complex chiral structures.
文中总结了利用解离的TE结构域(如Rdc-TE、Zea-TE)和游离的TE(如DcsB)进行化学酶合成大环内酯骨架方面的研究进展,并展望了C结构域在该领域的应用前景。作者认为,随着大环内酯生物合成机制的进一步阐明和新催化剂的发现,将极大促进药物研发等领域的发展。
重点内容与启示
对于对该领域感兴趣但缺乏背景知识的读者而言,本综述的价值体现在以下几点:
系统梳理了真菌大环内酯酯键引入的三大生物合成途径(PKS途径、NRPS途径和PKS-NRPS杂合途径)及其代表性化合物,这是理解该领域研究的基础。 深入讨论了参与酯键形成的关键酶———硫酯酶结构域和缩合结构域的催化机制、结构功能和调控因素,这是把握大环内酯骨架多样性形成机制的关键。正如作者所言: Given the importance of macrolides, recent important studies have summarised the synthesis of macrolides in bacteria, as well as the sources, isolation, and biological activities of fungal macrolides. A comprehensive discussion regarding the synthetic strategies and the mechanism in the formation of ester bonds in fungal macrolides has not yet been conducted. To bridge this gap, this review focuses on these two aspects as well as the chemoenzymatic application of discovering lactonization enzymes/domains.
介绍了多个有趣的研究案例,展示了基因簇发掘、异源表达、体外酶学分析、化学结构解析等多种研究策略在阐释复杂天然产物的生物合成机制方面的协同应用,对今后从事相关研究具有很好的启发意义。 对大环内酯生物合成酶在化学酶法合成中的应用前景进行了展望,表明天然产物生物合成研究的最终目的是为创制结构多样的新颖化合物提供酶学基础和合成工具,这对于开发新药、拓展化合物库具有重要意义。正如作者所指出的: Continued exploration of macrolide biosynthetic mechanisms and the discovery of new biocatalysts will significantly contribute to diverse applications across various fields.
对生物有机化学感兴趣的读者应重点关注真菌大环内酯酯键形成的多样性策略、TE/C结构域的结构功能关系,以及生物合成逻辑对工程改造天然产物骨架、创制新型大环内酯类化合物的指导意义。通过对本综述的深入解读,可以站在分子水平理解一类重要天然产物的构建机制,把握其研究进展和未来发展方向,这对开拓学科视野大有裨益。
Biosyn导师：邹懿
http://pharmacy.swu.edu.cn/info/1019/2162.htm
邹懿，博士，西南大学“含弘英才岗”教授，博士生导师。
国家海外高层次引进人才计划青年项目（2018）。重庆市学术技术带头人（2019）。重庆市教育系统优秀共产党员（2019）。重庆市杰出青年基金获得者（2020）。重庆市青年专家工作室领衔专家（2021）。西南大学“十三五”科研工作先进个人（2021）。西南大学十佳青年（2022）。中央高校优秀青年团队负责人（2023）。
2002-2009年于西南大学药学院，分别获制药工程学士和微生物与生化药学硕士学位。2013年于上海交通大学微生物代谢国家重点实验室获微生物学博士学位，研究方向为链霉菌来源的复杂结构天然产物生物合成，博士学位论文获上海市优秀博士学位论文奖。2014年-2017年，在美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）从事博士后研究工作，研究方向为真菌来源的复杂结构天然产物酶学合成和催化机理。2017年7月，通过西南大学“聚贤工程”人才引进加入药学院任职。近几年，以独立通讯作者或共同通讯作者在包括J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nat. Commun., Chem. Sci., ACS Catal., Org. Lett., Acta. Pharm. Sin. B.等国际著名期刊上发表文章数篇，相关成果多次被权威综述性杂志Nat. Prod. Rep.遴选为研究热点报道。
热忱欢迎有志于真菌天然药物合成生物学与生物酶催化机理研究的
青年教师、博士后、研究生和本科生加入课题组！
联系方式
E-mail: zouyi31@swu.edu.cn
教育与工作经历
2017. 06 - 至今 西南大学，药学院，教授，博士生导师
2014. 01 - 2017. 01 加州大学洛杉矶分校，化学与分子生物工程学院，博士后
2009. 09 - 2013. 12 上海交通大学，微生物代谢国家重点实验室，微生物学，博士
2006. 09 - 2009. 06 西南大学，药学院，微生物与生化药学，硕士
2002. 09 - 2006. 06 西南大学，药学院，制药工程，学士
研究方向
1. 真菌天然药物生物合成与酶催化机理
2. 真菌天然药物合成生物学与分子创新
主持的基金项目
1. 国家自然科学基金委面上项目（2022. 01-2025. 12，22177093）
2. 国家自然科学基金委面上项目（2019. 01-2022. 12，31870022）
3. 科技部重点研发计划合成生物学重点专项课题（2023. 12-2028. 11，2023YFA0914203）
4. 科技部重点研发计划合成生物学重点专项子课题（2020. 11-2025. 10，2020YFA0907700）
5. 国家海外高层次引进人才计划青年项目（A类资助）
6. 重庆市青年专家工作室领衔专家基金
7. 重庆市生物医药研发重大专项课题（2023. 01-2025. 12，CSTB2022TIAD-STX0015）
8. 重庆市杰出青年科学基金项目（2020. 09-2023. 08，cstc2020jcyj-jqX0005）
9. 重庆市留学生创新创业计划重点项目（2018. 01-2020. 12，cx2018006）
10. 西南大学自然科学领域校级青年领军团队项目（2023.07-2026.07，SWU-XJLJ202306）
11. 西南大学2035先导计划发展培育项目（2022. 06-2025. 05，SWU-XDPY22009）
12. 中央高校业务费重点项目（2018. 04-2019. 12，XDJK2018B035）
13. 西南大学“聚贤工程”人才启动基金（2017. 07-2020. 12，SWU117034）
14. 企业横向项目（2023.07-2026.07）
课题组研究生主持的科研项目
1. 重庆市博士研究生科研创新项目（2024.07-2026.04，CYB240125）
2. 重庆市博士研究生科研创新项目（2022.07-2024.04，CYB22142）
3. 重庆市硕士研究生科研创新项目（2024.07-2025.04，CYS240174）
学术机构任职
1. 中国菌物学会药用真菌专业委员会，副主任委员
2.《药学学报》中英文两刊青年编委
3.《Green Synthesis & Catalysis》青年编委
4.《Chinese Journal of Natural Medicines》青年编委
授权专利
1. 具有抗线虫活性的thermolides类化合物及其制备方法和应用，专利号：ZL202111276470.7
