研究目标和意义

这篇论文于12月3日在线发表于Cell。研究目标是开发一种专门针对外周组织的化学遗传学系统,即羟基羧酸受体DREADD系统(HCAD),以实现对外周组织的选择性调控,而不影响中枢神经系统。这对于研究外周生理功能、治疗外周疾病具有重要意义。如文章所述:

To address the development of a peripherally restricted DREADD system, we focused on the hydroxycarboxylic acid 2 (HCA2) receptor, which is a potentially useful template for the following reasons: first, although 94% of GPCRs whose endogenous ligands are known are expressed in the brain, the niacin receptor HCA2 is minimally expressed in the brain or other neuronal tissues and is instead expressed by innate immune cells that largely reside in barrier tissues (Figure S1). The relative absence of neuronal expression of HCA2 minimizes concerns related to potential actions of the drug at native neuronal receptors.

论文选择了**羟基羧酸受体2(HCA2)**作为设计DREADD系统的模板,因为它在大脑和神经组织中的表达很少,而主要在外周免疫细胞中表达。这就最小化了化学遗传学工具在神经系统产生非特异性作用的风险。该系统的开发将有助于特异性地研究和治疗外周组织相关的生理病理过程,如疼痛、炎症等,具有重要的科学和临床应用前景。

新思路、方法和优势

为了开发外周限制性的化学遗传学工具,论文提出了如下新思路和方法:

1. 在HCA2这个主要在外周表达的G蛋白偶联受体(GPCR)上进行定点突变,筛选出一个突变体R111K,它对内源性配体烟酸不敏感,却能被一种相对惰性的化合物MK-0354强烈激活。这就得到了一个理想的DREADD受体。
2. 在超大规模的化合物数据库中,根据MK-0354的结构进行类似物搜索,并通过实验筛选,最终得到一个高效、高选择性的配体AR259088,作为HCAD系统的激动剂。
3. 运用**冷冻电镜(cryo-EM)**技术,解析了HCAD受体与Gi蛋白及AR259088结合的三维结构,分辨率2.62Å,为理解其结构基础及进一步优化提供了宝贵的结构信息。
4. 系统评估了AR259088的药代动力学特性、脑渗透性、代谢稳定性及脱靶效应,证实其具有优异的外周限制性和安全性。
5. 在小鼠背根神经节(DRG)神经元中表达HCAD,并用生物发光共振能量转移(BRET)、电生理及动物行为学实验,验证了HCAD的功能,证实其激活可抑制DRG神经元兴奋性并减轻疼痛。

Figure 1. Structure-based design of HCAD

这些创新性工作极大地推进了外周限制性化学遗传学工具的发展。与之前依赖中枢表达受体(如hM3Dq、hM4Di等)的DREADD系统相比,HCAD系统特异性更高,脑渗透小,更适合研究外周组织,相关副作用也更小。同时,论文采用的冷冻电镜结构解析、计算机辅助药物设计、多种体内外功能评估方法,为今后开发其他类型的外周限制性化学遗传学工具提供了很好的范例。

论文中文标题:外周限制性化学遗传学工具HCAD的结构指导设计

1. 结构指导下设计出高度选择性的化学遗传学系统HCAD

为了开发外周限制性的化学遗传学工具,作者以羟基羧酸受体2(HCA2)为模板,采用结构指导的方法进行受体改造。通过对HCA2受体进行定点突变筛选,他们发现R111K突变体对内源性配体烟酸不敏感,但可被MK-0354等化合物激活。这为设计高选择性的**Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs)**奠定了基础。

作者进一步采用计算机辅助药物设计方法,从超过2亿个候选化合物中筛选出AR259088作为HCAD的特异性配体。与目前常用的DREADD配体CNO和DCZ相比,AR259088具有更高的选择性和更弱的脑渗透性:

>AR259088 lacked appreciable agonist or antagonist activity at any of the 318 tested GPCRs except for HCA2 (Data S1).FCH-2296413 exhibited a brain:plasma ratio of 0.07 after at 30 min post-injection of the compound (Figure 3E), whereas DCZ, which is known to penetrate blood-brain barrier (BBB) well, showed a brain:plasma ratio of 10.4 at 30 min post-injection (Figure 3F), indicating that FCH-2296413 displays a peripherally restricted profile (Table S7).

作者的工作极大地拓展了化学遗传学工具的多样性,使得在外周组织进行选择性调控成为可能。这对于解析外周组织的生理功能、寻找新的药物靶点具有重要意义。

Figure 3. AR259088对318个GPCR和97个激酶的筛选结果以及其药代动力学特性

2. 解析了HCAD与下游信号分子偶联的高分辨结构基础

为了理解HCAD的结构基础及其偶联特异性,作者运用冷冻电镜技术,解析了HCAD与Gi蛋白及AR259088形成复合物的三维结构,分辨率达到2.62Å。结构显示,AR259088与HCAD的关键结合位点主要集中在跨膜区,诱导HCAD胞外环和胞内环构象发生变化,从而有利于下游Gi蛋白的选择性偶联。

生物发光共振能量转移(BRET)实验进一步验证了上述结构推断,表明HCAD主要偶联Gi/o蛋白,而对其他类型G蛋白如Gq和G12的偶联能力较弱:

FCH-2296413 also exhibited weak effects on other G protein types, such as Gq class family and G12 class families. However, these effects were less than 50%, indicating that those non-Gi/o coupling effects remain minimal (Figure S4).

深入揭示HCAD与配体和下游效应分子相互作用的结构基础,不仅加深了对GPCR-G蛋白偶联选择性的理解,也为优化和拓展化学遗传学工具提供了重要依据。例如,可以进一步改造HCAD与其他G蛋白亚型如Gs的偶联,从而实现对cAMP等第二信使的特异性调控。

Figure 2. HCAD与配体和G蛋白形成复合物的冷冻电镜结构及分子动力学模拟

3. HCAD激活可有效抑制DRG感觉神经元的兴奋性

疼痛信号的产生和传导依赖于初级感觉神经元,尤其是背根神经节(DRG)的nociceptor。抑制DRG神经元的兴奋是治疗疼痛的重要策略。作者将HCAD表达于小鼠DRG神经元,利用电生理方法检测其对神经元兴奋性的影响。

膜片钳实验表明,HCAD特异性激动剂FCH-2296413可浓度依赖性地抑制DRG神经元的电压门控钙通道(VGCC)电流(图4B,C),延长动作电位的上升时间(图4D)。FCH-2296413还能使静息膜电位下降,动作电位发放减少(图4E-G)。这些效应在HCAD阴性的对照组神经元中并未观察到。

FCH-2296413 reduced the amplitude of voltage-activated calcium currents in HCAD-mCitrine+ neurons in a concentration-dependent manner. Specifically, at the concentration of 100 nM, FCH-2296413 did not produce any inhibition, although 1 and 10 μM of FCH-2296413 significantly inhibited VGCC (Figures 4B and 4C). Furthermore, calcium currents had slower kinetics following FCH-2296413 application (Figures 4B and 4D).

We found that FCH-2296413 significantly decreased the resting membrane potential (RMP) (Figures 4E and 4F) and reduced firing of action potentials (APs) (Figures 4E and 4G) in mHCAD-mCitrine+ DRG neurons.

与目前常用的Gi-DREADD受体hM4Di相比,HCAD的表达本身并不影响DRG神经元的静息膜电位、动作电位波形和兴奋性(图4H-N)。实时定量PCR结果也证实,HCAD不会像hM4Di那样在没有配体情况下诱导相关基因表达改变(图4O):

In contrast with hM4Di, mHCAD expression did not cause any detectable changes in gene expression (Figure 4O), including for SCN9A (sodium voltage-gated channel alpha subunit 9), which encodes the sodium channels Nav1.7, and was found to be upregulated in hM4Di-expressing DRG.

上述发现表明,HCAD是一个更"安静"、更理想的化学遗传学工具,其表达本身不会引入过多干扰,非常适合用于研究DRG等感觉神经元的生理功能及药理调控。未来可尝试将HCAD应用于三叉神经节、迷走神经等其他初级感觉神经元,以期实现对不同类型、不同部位疼痛的精准调控。

Figure 4. HCAD对DRG神经元兴奋性及相关离子通道、基因表达的影响

4. 在多个疼痛模型中验证了HCAD的镇痛效果

为进一步验证HCAD对疼痛的调控作用,作者在小鼠DRG神经元中特异性表达HCAD,评估其对多种类型疼痛的影响。在热板实验中,注射FCH-2296413可明显延长HCAD小鼠出现甩爪、舔爪等疼痛行为的潜伏期,降低疼痛行为的次数和持续时间(图5C, 6B-E)。

In the hotplate test of acute heat pain (Figures 5C and 6B–6E), FCH-2296413 significantly reduced the duration, and the number of forepaw licking, hindpaw licking, and jumping, as well as the overall number of these nocifensive behaviors, while increasing the latency to first nocifensive behavior (Figures 5C and 6B–6E) in mice expressing mHCAD in DRG nociceptors compared with control mice expressing tdTomato, suggesting mHCAD-mediated antinociception.

此外,在完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎性疼痛模型中,FCH-2296413也能明显改善HCAD小鼠对机械刺激和热刺激的敏感性(图5D,G),而对照组小鼠并未出现此改善。

Furthermore, in the complete Freund's adjuvant (CFA) model of tissue injury and chronic inflammatory pain (Figure 5D), FCH-2296413 reduced both mechanical and heat hypersensitivity in mHCAD-expressing mice, but not in control mice, establishing FCH-2296413 and mHCAD therapeutic anti-allodynic properties.

值得一提的是,FCH-2296413对HCAD小鼠的镇痛效果是可逆的。撤药后,疼痛阈值可恢复至基础水平(图5F)。与吗啡等镇痛药相比,HCAD激活并未引起运动、感知、代谢等方面的明显副作用(图5H-M):

FCH-2296413 had no effect on mechanical threshold as assessed with von Frey filaments in WT mice (Figure 5H). Similarly, FCH-2296413 induced no change in nocifensive behaviors in the tail immersion (Figure 5I), hotplate (Figures 5J and 5K), and Hargreaves tests (Figure 5L). Next, we examined the effect of FCH-2296413 on locomotion and anxiety in the open field test, and on motor coordination in the rotarod test. FCH-2296413 had no effect on WT mouse behavior in these assays (Figures 5M–5O).

这些实验提示,HCAD是一种有效且安全的外周镇痛新策略。相比目前临床上使用的阿片类药物,其成瘾风险更低;相比非甾体类抗炎药,其对胃肠道、心血管等的不良反应更小。HCAD介导的外周限制性镇痛为慢性疼痛的长期管理提供了新的选择。考虑到疼痛是最常见的就医原因之一,该策略的进一步优化和临床转化应用前景广阔。

图5

Figures 5-6.在急性和慢性疼痛模型中验证HCAD激活的镇痛效果

总结

本研究利用结构生物学指导下的定向进化策略,成功开发出一种高度选择性的、外周限制性的化学遗传学工具HCAD。与经典的DREADDs如hM3Dq和hM4Di相比,HCAD具有以下优势和特点:

1. HCAD的内源性模板HCA2主要在外周组织表达,其特异性激动剂AR259088极少透过血脑屏障进入中枢,减少了非特异性的中枢作用。
2. 通过对HCAD与配体和下游G蛋白偶联的高分辨结构解析,阐明了其选择性偶联Gi/o信号通路的分子基础。
3. 在多个电生理和动物行为学实验中,证实HCAD的表达本身不影响DRG感觉神经元的兴奋性,但其激活可有效抑制钙电流、动作电位,减轻急性和炎症性疼痛。
4. 与临床常用镇痛药相比,HCAD激活介导的外周限制性镇痛，在保留良好疗效的同时,具有成瘾性低、不良反应小等优点。

作者创造性地将化学遗传学与结构生物学相结合,极大地拓宽了现有化学遗传学工具的多样性和适用范围。随着对HCAD的进一步完善,以及对其他外周组织/细胞类型特异性DREADD的开发,外周化学遗传学有望在解析复杂生理过程、发现创新药物靶点等方面发挥越来越重要的作用。这项突破性的工作无疑将推动疼痛、炎症、代谢等多个疾病领域的研究和治疗范式革新。

学术和产业影响

作为第一个外周限制性化学遗传学工具的成功范例,HCAD系统的开发将在多个方面推动学术研究和产业应用:

1. 为研究外周组织(如免疫系统、内分泌系统等)的生理功能提供了有力工具,特别适合那些也在中枢有表达的受体或信号通路,有助于厘清外周和中枢的特异性作用。
2. 为开发治疗外周疾病(如疼痛、炎症、代谢紊乱等)的新药提供了新思路和新靶点。通过外周限制性的化学遗传学工具,可以最大限度地发挥药物在外周的治疗作用,而避免中枢副作用。
3. 为其他类型的外周限制性化学遗传学工具(如离子通道、激酶等)的开发提供了很好的范例。文中采用的以GPCR为模板、计算机辅助药物设计与优化、冷冻电镜结构解析等策略,都具有一定的普适性,值得借鉴。
4. 文章采用的cryo-EM、BRET、光遗传等前沿技术,也为相关研究人员和企业提供了很好的方法学指导,有助于扩大相关技术的应用,带动相关产业的发展。
5. 外周限制性化学遗传学工具的进一步发展,可能催生针对特定组织、疾病的个性化诊疗方案,为精准医疗带来新的突破。这将为相关创新药物、诊断试剂的开发带来广阔的市场前景。

进一步探索的问题和商业机会

基于目前的研究进展,外周限制性化学遗传学工具的开发和应用还有很多值得深入探索的问题:

1. 目前HCAD主要针对Gi偶联的受体,对于其他类型的受体(如Gs、Gq等),是否也能开发出相应的DREADD系统?这将进一步拓展化学遗传学工具的多样性。
2. HCAD主要应用于神经系统的调控,能否将其拓展到其他外周组织和细胞类型(如免疫细胞、内分泌细胞等)?这可能催生更多特异性调控外周功能的新方法和新药物。
3. 能否开发出其他类型的外周限制性化学遗传学工具,如离子通道、酶等?这需要发掘更多主要分布于外周组织的重要靶点,并采用新的定向进化和结构辅助设计策略。
4. 如何进一步提高HCAD配体的选择性、药代动力学特性和成药性?这可能催生出更多基于结构的药物设计和优化技术,并与人工智能算法相结合,加速药物研发进程。
5. HCAD能否应用于其他外周疾病模型(如炎症、代谢、内分泌疾病等)?通过建立疾病动物模型并与现有药物进行疗效比较,有望发现新的治疗策略和先导化合物。

Critical Thinking

• HCAD系统主要在小鼠DRG神经元中得到验证,但对于人的外周组织是否也有类似效果,还需要进一步确认。文章提到人和小鼠HCA2序列有81.9%的同源性,但并不代表二者功能完全一致,需要更多人源细胞和组织的直接验证。
• 论文只评估了HCAD对Gi信号通路的偏好性,但并未完全排除其他信号通路的影响。如文中提到FCH-2296413对Gq、G12家族的激活可达50%左右,虽然相比Gi激活较弱,但在过表达条件下仍可能影响细胞功能,需要设计更敏感和特异的实验予以区分。

正如文章讨论,作者也提到:

To address this, we recommend using more sensitive detection techniques capable of capturing weak or transient G protein signaling in vivo.

1. HCAD对DRG神经元及小鼠疼痛的抑制作用,是在病毒介导的过表达条件下得到的,而内源性HCA2受体的水平可能较低,FCH-2296413能否有足够的治疗效果还不确定。这可能需要进一步优化化合物的药效学性质,或采用更高效、持久的基因递送方法。
2. 文章主要评估了FCH-2296413对疼痛相关行为学指标的影响,但对炎症反应本身、神经递质/因子的释放等并没有直接检测。HCAD激活究竟通过何种下游机制缓解疼痛,还需要补充更多实验数据,以加深机制理解。
3. HCAD系统能否适用于慢性病痛模型,如神经病理性疼痛、癌性疼痛等?这类病痛往往涉及更复杂的中枢敏化机制,单纯抑制外周信号的传入可能不够。需要在更多模型中探索HCAD的疗效,并考虑与其他药物/手段联合应用。
4. 文章缺乏长期、重复给予FCH-2296413的安全性评估数据。虽然急性使用没有明显副作用,但长期激活外周Gi信号对机体的影响还不得而知。未来需要开展系统的安全性毒理学研究,并密切监测可能出现的外周组织炎症、代谢紊乱等风险。