研究目标、意义及产业价值
本文于2024年11月26日在线发表于Nature Chemistry。研究目标是利用定向进化技术,重新设计烯还原酶(EREDs),使其能够高效催化羰基的不对称脱氢反应,特别是环己酮的脱氢反应,生成含有季碳手性中心的环己烯酮产物。这类手性环己烯酮是许多生物活性分子的关键合成前体。
>Carbonyl desaturation is a fundamental reaction widely practised in organic synthesis. While numerous methods have been developed to expand the scope of this important transformation, most of them necessitate multi-step protocols or suffer from the use of high loadings of metal or strong oxidizing conditions. Moreover, approaches that can achieve precise stereochemical control of the desaturation process are extremely rare.
传统的羰基脱氢方法通常需要多步骤、使用大量金属催化剂或强氧化条件,而且很难实现立体化学的精确控制。本文的酶催化脱氢方法能在温和条件下一步合成手性环己烯酮,具有很大的应用价值。
Products as valuable chiral building blocks in total synthesis
图1
这些手性环己烯酮是全合成中宝贵的手性砌块,可用于合成多种复杂天然产物和药物分子,如platencin、songorine、crispatanolide等,说明本研究有很大的产业应用前景。
创新思路、方法及优势特点
本文的关键创新在于利用定向进化技术重新设计烯还原酶,使其能催化与天然底物相反的脱氢反应。这需要克服两大挑战:
逆向脱氢在热力学上是不利的 产物烯酮容易进一步歧化,导致降低产率
Natural EREDs catalyse the asymmetric reduction of activated C=C bonds using the reduced form of the flavin cofactor (flavin hydroquinone, FMNhq). However, the reverse dehydrogenative activity of these enzymes has been much less explored.
天然的EREDs利用还原态的黄素辅因子(FMNhq)催化C=C双键的不对称还原。但逆向的脱氢反应鲜有研究。
为了克服上述挑战,本文采取了两大策略:
通过筛选不同来源的EREDs,寻找对羰基脱氢有初始活性的hit ; 通过定向进化优化hit酶的催化效率和选择性。
这两个策略的结合,让作者成功开发出一类高效、高选择性的"逆向"脱氢酶。相比现有方法,该酶系统具有以下优势:
This biocatalytic transformation would enable the one-step enantioselective synthesis of cyclohexenones possessing a distant quaternary stereogenic centre. Such compounds are highly valuable chiral building blocks, used extensively in the synthesis of a diverse range of bioactive molecules.
实现手性环已烯酮的一步合成,产物含有一个较远的季碳手性中心,是重要的合成砌块。
Our biocatalytic desaturation platform represents a valuable advancement with broad synthetic utility, enabling access to a diverse array of cyclohexenones featuring a remote quaternary chiral centre under mild conditions using air as the terminal oxidant.
生物催化脱氢平台在温和条件下就能获得多样的手性环已烯酮产物,以空气为最终氧化剂,具有广泛的合成应用价值。
This desymmetrizing dehydrogenation reaction sets the stage for the future development of biocatalytic desaturation systems with reactivity and selectivity unmatched by those of small-molecule catalysts.
这一脱对称氢策略为今后发展具有小分子催化剂无法企及的反应性和选择性的生物催化脱氢体系奠定了基础。
烯还原酶逆向催化活性的发掘与应用:酶促羰基不对称脱氢新方法学
本文的一个核心发现是,通过定向进化,烯还原酶(EREDs)可以高效催化其天然反应的逆过程,即羰基脱氢反应。作者利用底物筛选和定向进化相结合的策略,成功获得了一系列高活性、高选择性的EREDs突变体,能在温和条件下实现环己酮类底物的不对称脱氢,构建含有季碳手性中心的环己烯酮产物(图3,4)。这一发现突破了EREDs在有机合成中的局限性,极大拓展了其应用范围。
图3
图4
Here we report a biocatalytic platform for desymmetrizing desaturation of cyclohexanones to generate diverse cyclohexenones bearing a remote quaternary stereogenic centre, by reengineering 'ene'-reductases to efficiently mediate dehydrogenation, the reverse process of their native activity.
1. 通过底物筛选和定向进化,获得高效脱氢突变体CrS1和GkOYE3
图2
首先,作者从一系列天然EREDs中筛选,发现CrS和GkOYE能以中等产率(30-49%)和优异对映选择性(98:2 e.r.)催化模型底物4-methyl-4-phenylcyclohexanone的脱氢反应(图2a)。接着,他们以CrS-WT和GkOYE-WT为起点,通过1-3轮饱和突变(ISM)获得了性能大幅提升的突变体CrS1(Y27L)和GkOYE3(C26S, Y28V, D73G),产率分别达到79%和96%,e.r.高达98:2和>99:1(图2b)。
>Among the enzymes tested, the majority displayed minimal activity in generating the desired product 2 (Fig. 2a, entries 1–3 and Supplementary Table 1). OYE1, OYE2, CrS and GkOYE exhibited modest activity (10–14% yield) with promising levels of enantioselectivity (Fig. 2a, entries 4–7).
>From CrS-WT, we found that mutating Y27 to less sterically hindered amino acid residues evidently increased the dehydrogenative activity. For instance, the single mutants CrS1 (Y27L), CrS2 (Y27C) and CrS3 (Y27T) delivered 2 in 79% yield (98:2 e.r.), 88% yield (98:2 e.r.) and 81% yield (97:3 e.r.), respectively. From GkOYE-WT, three rounds of ISM resulted in a triple mutant, GkOYE3 (D73G, C26S and Y28V), catalysing the formation of 2 in 96% yield (>99:1 e.r.).
2. GkOYE突变体对环己酮类底物表现出优异的普适性和对映选择性
图3
接下来,作者系统考察了GkOYE突变体对各种取代环己酮的脱氢性能。令人惊喜的是,从图3可以看出,无论是苯环上连有吸电子基团(3, 5)还是给电子基团(4, 6, 7),以及各种杂环取代基(10-13),脱氢产物的收率大多在90%以上,e.r.普遍>99:1。此外,该酶系统还能兼容传统化学氧化方法不相容的氨基(8)、硫醚(7)等基团,彰显了其独特优势。一些复杂环己酮底物如19甚至能以75%的收率和>99:1 e.r., >20:1 d.r.的立体选择性得到相应产物。
>Substituents including 3-chloro (3), 4-methoxy (4), 4-trifluoromethyl (5), 4-dimethylamino (6) and 4-methylthio (7) on the phenyl ring of the cyclohexanones were well tolerated. ... Notably, this biocatalytic desaturation protocol displayed high tolerance towards oxidation-sensitive functional groups, such as amine and thioether, highlighting its complementary reactivity to classic synthetic methodologies. ... Furthermore, a diverse range of ester-containing cyclohexanones readily participated in the reaction, affording the corresponding products (44–50) in good yields with excellent levels of enantioselectivity.
3. 酶系统的实用性:克级规模制备及衍生化应用
图5
为了考察酶法脱氢的实用性,作者进行了克级规模的制备实验(图5a,b)。以6 mmol原料1为例,在GkOYE2催化下,用湿菌体可获得88%收率、>99:1 e.r.的环已烯酮2,产量达0.99克;而使用冻干菌粉的制备结果也相当不错(81%收率,0.91克)。此外,他们还将脱氢产物进行了多样性衍生,如61经三步以62%收率得到具有药理活性的生物碱(+)-mesembrine;2可转化为季碳高度官能团化的环已烯酮62(67%收率, >99% e.s.)或Diels-Alder环加成产物63(71%收率,>99:1 e.r., 7:1 d.r.), 充分展现了该方法在复杂分子合成中的应用价值。
>Next we investigated the substrate tolerance of our enzymatic system using a focused enzyme library containing beneficial mutants obtained during the evolution campaign. A variety of 4-alkyl-4-aryl cyclohexanone substrates were tested against this enzyme library (Fig. 3).
>To evaluate the synthetic utility of this enzymatic desaturation protocol, we conducted the model reaction on gram scale (6.0 mmol) and obtained product 2 in 88% yield, >99:1 e.r. (0.99 g) with wet lysate and 81% yield, >99:1 e.r. (0.91 g) with lyophilized lysate (Fig. 5a). Furthermore, we successfully performed the desaturation of cyclohexanone 60 on gram scale (Fig. 5b), yielding the cyclohexenone product 61 in 86% and 83% yields with >99:1 e.r., employing wet and lyophilized lysate, respectively. This product was then transformed into (+)-mesembrine, an alkaloid with serotonin reuptake inhibition activity, with outstanding diastereoselectivity. Moreover, the cyclohexenone products prepared through the enzymatic desaturation process were effectively diversified into valuable chiral compounds with high levels of enantiospecificity (Fig. 5c).
4. 机理研究揭示酶促脱氢关键步骤:α-去质子化和β-氢转移
图6
最后,作者对酶促脱氢机理进行了系统研究(图6)。重氘交换和Y169A突变实验证实了保守残基Y169在底物α-去质子化步骤中的关键作用(图6a-c),自由基钟实验排除了单电子转移机理的可能性,支持β-氢直接转移的历程(图6d)。同位素标记动力学研究给出了α位和β位的**动力学同位素效应(KIE)**值分别为2.0±0.3和10±2(图6e),进一步佐证了"α-去质子化/β-氢转移"的反应机理。动力学研究表明,定向进化获得的突变体GkOYE3在脱氢、辅因子再生、耦合氧化等三个关键步骤上均优于野生型(图6f)。这些机理认知为后续的酶工程提供了重要指导。
>A protium–deuterium exchange experiment indicated that Y169 facilitated the α-deprotonation. ... The knock-out experiment suggested that Y169 played an important role in the desaturation reaction. ... The radical clock experiment suggested that the β-C–H cleavage occurred via hydride transfer instead of SET. ... The KIEs were consistent with the proposed reaction pathway involving α-deprotonation and β-hydride transfer. ... Kinetic studies indicated that the evolved mutant is better for desaturation in all the three key steps.
本文从天然EREDs出发,通过定向进化获得了一类高效的"逆向"羰基不对称脱氢酶,可在温和条件下实现环己酮类化合物的脱氢反应,构建含季碳手性中心的关键合成子。这一酶促脱氢新方法学在底物适用范围、官能团兼容性、对映选择性等方面均优于传统化学合成,同时具有应用于克级规模制备的潜力。这些突破性进展标志着生物催化在不对称脱氢领域迈出了关键一步,为今后发展高效、普适、立体专一的脱氢酶奠定了重要基础。
给业界带来的影响、潜在应用及商业机会
本研究不仅在学术上具有重要创新,而且在合成应用和工业生产方面也具有广阔前景:
开辟了一条制备手性环已烯酮的新途径。这类化合物是药物、农药等的重要合成砌块,在工业上有较大需求。酶法制备具有原子经济性高、条件温和、官能团兼容性好等优点,有望取代现有的化学合成方法。 拓展了EREDs的应用范围。传统上EREDs主要用于还原反应,本研究开发了它们在氧化脱氢领域的新用途。这种"逆向"催化模式也可以推广到其他氧化还原酶,催生出更多新颖的酶促氧化反应。 展示了定向进化等生物工程手段在创制新型酶催化剂方面的强大威力。通过基因多样性挖掘和定向进化,可快速改造酶的催化机制,使其能催化天然不具备的新反应。这无疑会极大地推动生物催化技术的发展。 对开拓手性药物中间体的酶法制备途径具有重要的启发意义。特别是针对一些传统化学方法难以实现的不对称氧化反应,利用酶的高选择性优势,有望实现手性砌块的高效制备。这将极大地推动手性药物工业的发展。
本研究为从事有机合成、药物开发、酶工程等领域的科研人员提供了诸多新思路和新方法。未来可以在本研究基础上,进一步拓展底物适用范围,挖掘适用于脱氢的新型氧化还原酶,并优化其催化性能,最终建立起普适性更强、效率更高的酶促脱氢合成方法学,造福有机合成及相关产业。
未来进一步探索的空间、相关技术及投资机会
虽然本研究已经初步建立了一个高效、高选择性的酶促羰基不对称脱氢方法,但未来在该领域仍有不少值得深入探索的问题:
底物适用范围还有待进一步拓展,如非环状酮、酯、酰胺等都是很有应用价值的脱氢底物。针对不同结构的底物,可能需要设计结构更diverse的EREDs突变体库,并筛选出专一性更高的脱氢酶。 除EREDs外,其他一些氧化还原酶如P450、黄素单加氧酶等可能也具有脱氢催化潜力。对这些酶的催化机制及调控元素进行深入研究,有望发现和创制出更多新型脱氢生物催化剂。 酶的稳定性、表达量、底物渗透性等决定了其在工业生产中的应用性能。如何从蛋白质工程的角度对酶进行定向改造,以满足规模化制备的需求,是一个需持续优化的过程。 酶催化不对称脱氢反应的机理研究还很有限。借助计算化学、分子模拟等手段,从理论上阐明其立体选择性控制机制,对指导后续的酶设计和改造至关重要。 本研究成果可进一步向工业化方向推进,如何优化底物浓度、酶用量、反应参数,并与下游分离纯化工艺有效衔接,最终实现手性环已烯酮等砌块的绿色工业生产,将是后续的重要课题。 将生物催化脱氢与化学催化、电化学等其他手段相结合,建立化学-生物协同催化体系,有望实现互补优势,催生出多种高效的混合催化新模式。
Critical Thinking
虽然作者系统考察了多种取代的环己酮底物,但非环状酮、酯、内酰胺等重要羰基化合物并未涉及。对底物适用范围的普适性还需进一步验证。 作者只筛选了几种常见的EREDs,而这类酶在自然界的多样性远不止于此。从更多来源尤其是一些极端环境微生物中发掘新的EREDs,可能有助于获得催化活性或选择性更高的脱氢酶。 虽然作者对脱氢的反应机理进行了比较深入的研究,但一些关键中间体如烯醇负离子、半醌自由基等并未得到直接表征,其存在还有待进一步的波谱学证据。 酶促脱氢的量子化学模拟研究还比较缺乏。借助 DFT 等从头算方法,对反应的能量学和动力学进行计算,有助于从理论上阐明其立体选择性控制机制,但文中没有涉及这方面的工作。 尽管作者进行了 1-3 克级别的放大实验,并将脱氢产物应用于一些衍生化反应,但离实际工业应用还有不小差距。对于工业应用,底物浓度、酶用量、反应条件等都需要进一步优化。产物的分离纯化成本也是需要考虑的因素。 手性环己烯酮产物的绝对构型虽然可以从晶体结构得到证实,但对于非固体的产物,文中并未给出确定其构型的具体依据和实验数据,有待补充。 作者重点关注的是酶的催化效率和选择性,而对其稳定性关注不够。工业应用中,酶的操作稳定性和储存稳定性也是重要指标,这方面还需进一步优化和表征。
Biosyn导师：叶宇轩
https://www.westlake.edu.cn/faculty/yuxuan-ye.html
个人简介
叶宇轩，1991年生于江苏南京。2013年于北京大学化学与分子工程学院获得学士学位，指导教师为王剑波教授和张艳教授。本科期间在美国加州大学洛杉矶分校Neil Garg教授课题组进行了暑期科研交流。2018年在美国麻省理工学院获得博士学位，指导教师为Stephen Buchwald教授。2019–2022年在美国普林斯顿大学和康奈尔大学开展博士后研究，合作教师为Todd Hyster教授。叶宇轩博士于2022年9月全职加入西湖大学理学院担任特聘研究员，主要研究方向为新型酶催化非天然反应的发展和应用。
学术成果
叶宇轩博士的研究涉及酶催化，光催化和金属催化等领域。
1. 利用光酶协同催化，首次实现了酶对高活性的氮自由基中间体的控制，实现了酶催化的不对称自由基氢胺化反应，为传统催化中较为困难的氮自由基手性控制提供了普适的解决方法。
2. 参与发展了第一个光酶催化高通量筛选平台，实现了光催化条件下酶的定向进化。这个平台为光酶催化新反应性的发现和优化奠定了基础。
3. 发展了新的膦配体，首次实现了钯催化的烯基亲核氟化反应，并对其中的添加剂效应进行了深入研究，提出了一种全新的经历去芳构化中间体的转金属机理。
4. 发展了一系列吲哚，吲唑，和苯并咪唑亲电试剂，利用极性反转策略，实现了高效的铜氢催化的含氮杂环选择性不对称烷基化反应。
