论文的研究目标和意义
这篇论文于2024年11月11日在线发表在Nature Structural & Molecular Biology上。旨在通过冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒分析,解析出酵母神经酰胺合成酶(ceramide synthase, CerS)复合物的结构。CerS是一类参与神经酰胺合成的关键酶,它催化鞘氨醇(sphingoid base)与酰基辅酶A(acyl-CoA)的N-酰基化反应,生成神经酰胺。神经酰胺是重要的鞘脂,在细胞信号、癌症发生、肥胖、2型糖尿病等多种生理病理过程中发挥关键作用。
Ceramides are pivotal players in sphingolipid metabolism1. They are active signaling molecules intricately involved in vital cellular processes2,3. Moreover, they function as critical intermediaries in the biosynthesis of complex sphingolipids such as sphingomyelin and glycosphingolipids4.
然而,长期以来CerS的精确结构细节和催化机制一直不清楚。这严重阻碍了针对CerS的药物开发和神经酰胺代谢紊乱相关疾病的治疗。因此,解析CerS的结构,阐明其催化和调控机制,对于开发选择性CerS抑制剂、治疗代谢综合征等疾病具有重要意义。
Understanding how CerSs catalyze the ceramide biosynthesis reaction and how fatty acids are selected is crucial to developing selective therapeutics that can potentially circumvent the catastrophic effects of global ceramide inhibition.
论文的创新思路和方法
作者通过冷冻电镜单颗粒分析,解析出了3种状态下的酵母CerS复合物的高分辨率结构:
Apo态的Lag1-Lac1-Lip1异源四聚体结构,分辨率3.0Å
与极长链脂肪酸(VLCFA)及两分子脂质结合的活性状态结构
与CerS抑制剂伏马毒素B1(fumonisin B1, FB1)结合的抑制状态结构,分辨率3.2Å
之前的研究主要采用同源建模等计算方法预测CerS结构,缺乏实验验证。本文则首次通过实验解析出了多个状态下的CerS结构,揭示了关键的催化中心、底物结合方式及抑制机制等重要信息。这为深入理解CerS的催化机制、开发特异性抑制剂提供了关键结构基础。
同时,本文发现酵母CerS为Lag1-Lac1-Lip1的异源四聚体,这一组装方式不同于之前在哺乳动物细胞中发现的CerS同源二聚体。这表明不同物种CerS可能存在组装和调控机制上的差异性,这对于筛选物种特异性抑制剂具有重要意义。
Our data provide evidence for competitive binding of fumonisin B1 to the acyl-CoA-binding tunnel.
Importantly, this configuration prohibits direct contact between the catalytic Lac1 and Lag1 subunits postulated for human CerSs.
酵母神经酰胺合成酶复合物的冷冻电镜结构研究
1. 解析了酵母CerS复合体的高分辨率三维结构
通过冷冻电子显微镜单颗粒分析,作者解析了酵母CerS复合物的高分辨率三维结构(分辨率达3.0Å)。结构显示,该复合物由Lag1、Lac1、Lip1三种亚基组成异源四聚体,呈现出伪二重对称性(pseudo-C2 symmetry)。其中:
Our structural analysis revealed a pseudo-C2-symmetric heterotetramer formed by two subunits of the single-pass transmembrane protein Lip1 and one of each catalytic subunits Lag1 and Lac1 in each half. (Fig. 1)
Lip1亚基形成中央同源二聚体,作为支架将两个催化亚基Lag1和Lac1连接起来。这一组装方式不同于哺乳动物CerS的二聚化模式。它揭示了酵母CerS独特的结构组装特征,为深入研究其催化机制奠定了重要基础。
Fig. 1: Architecture of the yeast CerS complex.
同时,作者还解析了与极长链脂肪酸(VLCFA)及两个脂质分子结合的活性状态结构,以及与抑制剂FB1结合的抑制状态结构(分辨率3.2Å)。这些结构从不同角度揭示了底物结合、催化反应及调控机制的关键信息。
Furthermore, we solved the FB1-bound inhibited conformation of the complex. (Fig. 5a)
Fig. 5: FB1 blocks the cytosolic ligand entry site of the CerS.
2. 鉴定出了CerS催化腔及关键催化残基
在Lag1和Lac1亚基中央,作者鉴定出了一个由8个跨膜螺旋形成的大型疏水腔。两个进化保守的组氨酸残基(H255和H256)位于其中心,对酶活性至关重要。这表明该疏水腔可能是CerS催化反应的活性中心。
The evolutionarily conserved residues (H255, H256, D283, D286 and W371 in Lag1 and Lac1), which are critical for catalytic activity, are located at the midpoint of a cavity, supporting the location of the active center of the enzyme. (Fig. 2g,h and Fig. 3c-h)
此外,腔内还发现了一个疏水隧道,连通胞质和内质网腔两侧。突变分析证实,疏水隧道对底物进出和催化活性至关重要(Extended Data Fig. 6,7)。这为阐明CerS的底物运输和催化机制提供了关键结构基础。
Fig. 3: Surface properties of the CerS linked to its function. The internal cavities and putative binding sites of CerS are shown.
3. 发现了极长链脂肪酸底物与催化组氨酸共价结合
在活性中心疏水腔内,作者观察到了一个延伸的电子密度,与H255催化残基相连。与之对应的Lac1-H255F突变导致酶活性丧失。
another region of density is located in a hydrophobic cavity at the center of the complex, stretching toward the luminal opening of the complex. Because CerSs use a sphingoid base (PHS) and a CoA-bound very-long-chain fatty acid (VLCFA) as substrates, the observed density could resemble either PHS or CoA-free VLCFA. (Fig. 2g,h)
这提示该密度可能是一个共价连接的极长链脂肪酸底物。结合已知的"乒乓机制",作者推测VLCFA底物首先与催化组氨酸形成酰基-咪唑中间体,然后再转移到鞘氨醇上完成酰胺键形成。
A recent study of the mammalian CerS6 proposed a catalytic ping-pong mechanism where the acyl chain is transferred from the CoA to the catalytic histidine, where it is covalently linked before being transferred to the amino group of long-chain bases (LCBs).
这一结果首次在结构水平上揭示了CerS催化反应的关键中间态,为阐明其催化机制提供了直接证据。
4. 阐明了Acb1在CerS底物转运中的重要作用
Acb1蛋白此前被认为对CerS活性至关重要,但具体机制不清。通过对接模拟和突变实验,作者发现Acb1可以特异性结合在CerS的胞质侧开口附近,并通过静电相互作用稳定酰基辅酶A底物(Fig. 4)。
Through these computational models, we identified two positively charged amino acids in Lac1 and Lag1 (K389 and R392) that potentially form salt bridges with D23 and E57 in Acb1. This arrangement situates Acb1 directly above the cytosolic opening of CerS, suggesting a potential mechanism for transferring the activated acyl chain from Acb1 to CerS.
敲除这一结合位点导致体外酶活性下降,体内鞘氨醇水平升高。这表明Acb1在体内可能通过促进极长链酰基辅酶A底物的转运,从而辅助CerS的催化功能,这一机制在酵母中尤为重要。
Fig. 4: Acb1 is important for CerS activity.
5. 揭示了FB1抑制CerS的分子机制
为了探究CerS抑制剂FB1的作用机制,作者解析了FB1结合状态下的CerS结构。发现FB1以一种竞争性方式阻断了酰基辅酶A底物的入口,其长链结构也占据了疏水腔的大部分空间(Fig. 5b-d)。
Single-particle cryo-EM of the FB1-treated CerS resulted in a structure resolved with 3.2 Å resolution (Fig. 5, Extended Data Fig. 3 and Table 1). Compared to the uninhibited structure, large-scale conformational changes were not observed in our FB-incubated sample. However, an additional region of density appeared at the cytosolic entrance of the funnel-like cavity, which we interpreted as the added inhibitor FB1. (Fig. 5a,b) The data show that the sphinganine-like hydrocarbon chain of FB1 extends into the hydrophobic cavity, placing the amino group near the H, D and W residues, which are important for the catalytic activity. (Fig. 5d,e) The ester-linked tricarballylic acids of FB1 block the entrance of the cavity where the acyl-CoA-docking site is expected.
这清楚地解释了FB1抑制CerS催化活性的机制。同时,FB1结合还诱导疏水腔入口处的跨膜螺旋发生构象改变,这可能进一步稳定了抑制状态(Fig. 5f,g)。这些发现为理性设计特异性CerS抑制剂提供了关键结构基础。
综上所述,这项研究运用冷冻电镜技术,系统解析了酵母CerS复合物的多状态高分辨率结构,并通过生化和功能实验对关键结构基于进行了验证。研究发现,酵母CerS由Lip1-Lac1-Lag1组成异源四聚体,与哺乳动物CerS存在组装差异;揭示了位于亚基中央的关键疏水催化腔及催化残基;首次观察到了VLCFA底物与催化组氨酸共价结合的中间态;阐明了Acb1参与底物转运的分子机制;解析了抑制剂FB1与CerS结合的界面特征及诱导的构象变化。
这些发现从结构水平上全面阐释了酵母CerS的组装特点、催化机制、底物转运及抑制模式,突破性地回答了该领域长期悬而未决的关键科学问题。这不仅极大地加深了我们对鞘脂代谢调控机制的认识,也为神经酰胺代谢相关疾病的药物研发指明了方向。同时,所建立的研究策略也可广泛应用于其他重要膜蛋白的结构与功能研究。
论文的影响和潜在应用
本文解析的CerS结构,为深入研究其催化机制、开发选择性抑制剂提供了关键结构基础。这将极大推动神经酰胺代谢相关疾病如代谢综合征、神经退行性疾病等的药物研发。同时,这也为鞘脂代谢和CerS的进一步机制研究提供了重要工具和新视角。
特异性CerS抑制剂有望成为治疗肿瘤、神经退行性疾病、皮肤病等多种疾病的新策略。目前,针对CerS1的选择性抑制剂已被开发出来,并被证实在脂肪代谢中发挥新功能。
Selective therapeutics will be necessary to circumvent the potentially catastrophic effects of global ceramide inhibition.
同时,CerS在农业领域也可能存在应用价值。FB1是一种真菌毒素,可抑制CerS活性,其类似物可能作为抗真菌农药应用于农业。而且,通过调控植物CerS活性,可能改善作物抗逆性状。这些都值得进一步研究。
尚待解决的科学问题和未来研究方向
尽管本文解析了酵母CerS的结构,但基于其序列和功能的保守性,哺乳动物CerS的结构和机制仍需进一步探索。此外,人类6种CerS亚型的底物偏好性、组织特异性分布、互作蛋白网络等方面仍存在诸多悬而未决的问题。
Mammalian cells express six different CerSs, CerS1–CerS6, that are also tissue specific in organisms. The six different CerSs have different acyl chain length optima26–29. CerS5 and CerS6 prefer C16:0, CerS1 prefers C18:0 and CerS2 and CerS4 prefer both C22:0 and C24:0 acyl-CoA substrates. Only CerS3 exhibits a broad specificity.
深入理解CerS与其他蛋白的相互作用和调控机制,对于阐明其生物学功能和开发药物具有重要意义。此外,CerS在疾病发生中的具体作用机制,仍需更多研究。
Critical Thinking
本文虽然解析了酵母CerS的结构,但与哺乳动物CerS仍存在一定差异。例如酵母CerS含有8个跨膜螺旋,两个亚基的N端和C端均位于胞质一侧;而哺乳动物的CerS含有7个跨膜螺旋,N端在内质网腔内。这可能影响底物结合和催化反应。因此酵母CerS的机制可能不能完全代表哺乳动物。
Lag1 and Lac1 both harbor eight TMs, placing both termini in the cytosol47. Therefore, the yeast CerS appears to differ from the mammalian CerSs, which harbor seven TMs. Additionally, yeast CerSs lack the cytosolic homeobox found in the catalytic subunits of mammalian CerS2–CerS631.
本文主要通过FB1和Acb1推断了底物进出通道,但并未直接解析到完整底物或产物的结合状态。关于酰基在催化组氨酸上的共价结合状态,仍需更多实验证据支持。
对于哺乳动物CerS,虽然作者提出其二聚化结构域可能参与更高级寡聚化,但仍缺乏实验证据。不同物种CerS组装方式的差异及其生物学意义,仍需深入研究阐明。
Biosyn导师：Arne Möller https://moeller-lab.com/team/
当前职位与工作单位：
德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系结构生物学研究组主任
该系ABC转运蛋白研究实验室负责人
办公地点：Barbarastraße 13号，49076奥斯纳布吕克
研究方向：
专注于膜蛋白的结构生物学研究
主要使用冷冻电镜(cryo-EM)技术
研究蛋白质和大分子复合物的分子结构
致力于理解膜蛋白的结构-功能关系
