综述的主要目的和意义

本综述在2024年9月2日在线发表于Nature Reviews Chemistry。主要目的是系统总结金属酶中质子耦合电子转移(PCET)反应的构象门控机制。作者重点梳理了三个代表性金属酶(固氮酶、光系统II和核糖核苷酸还原酶)中,蛋白质构象变化如何精确调控电子和质子的转移,实现高效催化的分子机制。综述认为,在当前阶段对这一问题进行回顾和展望有重要意义:

Ultimately, the question of why these proteins use conformational changes to gate PCET reactions remains unanswered. Our hypothesis is that under the constraints imposed by homoeostasis, which dictate relatively thermoneutral reaction landscapes, proteins have evolved to rely on structural control to maintain specificity and fidelity.

即这些构象门控机制如何在体内稳态条件下实现对PCET反应的高度特异性调控,仍是一个亟待回答的科学问题。系统阐明其分子机制,有助于理解金属酶的催化策略,为仿生催化剂设计提供新思路。

对研究历程的回顾和梳理

综述主要回顾了PCET和构象门控研究在过去几十年的发展历程,将其划分为理论基础构建和三个金属酶体系深入研究两个主要阶段:

1. PCET理论基础的奠定。这一阶段的标志性进展包括:

• 1961年,Mitchell提出PCET是生物体储存和利用自由能的基本机制

• Marcus理论将热力学和动力学因素引入PCET反应速率的描述

• PCET的四种基本模式(协同PCET、分步ET-PT、分步PT-ET和氢原子转移)得到确立

2. 三个金属酶体系PCET构象门控机制的阐明。这一阶段通过各种结构生物学和光谱学等方法,在分子水平上揭示了构象变化与PCET之间的内在联系,主要成果包括:

• 固氮酶: 发现Fe蛋白与MoFe蛋白的结合驱动构象变化,从而触发P簇向FeMo辅因子的电子转移,而ATP水解驱动Fe蛋白构象弛豫和电子回填。

Conformational changes controlling ET lead to an increase in exposed protein surface area, estimated as comprising ≥800 Å2.

• 光系统II: 发现激发态驱动的蛋白质构象变化(如D1亚基和质体醌结合位点),控制电荷分离和质体醌还原的PCET过程。

The rate-determining step of turnover in PSII consists of a protein structural rearrangement, suggesting that nature has evolved to leverage macroscopic changes in protein molecular structure to control subatomic changes in metallocofactor electronic structure.

• 核糖核苷酸还原酶: 发现底物结合触发的构象变化控制Tyr自由基在两个亚基之间长程转移的PCET过程。

The rate-limiting step for catalytic turnover in the pre-steady state is a protein conformational change that is triggered by substrate binding.

金属酶构象门控质子耦合电子转移的关键研究进展

固氮酶内部的"倒流电子转移"和"半位点反应性"

综述指出，近期在固氮酶研究中取得了两个重要突破。首先是发现了一种反直觉的"倒流电子转移"现象。

Counterintuitively, the immediate result of nucleotide-dependent protein conformational changes triggered by docking of FeP to MoFeP is not electron injection from FeP to MoFeP. Instead, the immediate result is ET from the P-cluster to FeMoco.

通过对固氮酶变种蛋白的光谱学研究，作者发现由FeP结合引发的构象变化，并非如预期那样直接导致FeP向MoFeP注入电子，而是触发了从P-簇到FeMoco的电子传递（图3），随后FeP再将电子补充到P-簇。这一"倒流-再充电"机制确保了催化所需的电子供给，同时避免了活性位点暴露在过多电子之下。

图3

另一项突破是通过冷冻电镜技术直接观测到固氮酶的"半位点反应性"。即FeP与MoFeP形成复合物后，催化主要在MoFeP的一个αβ亚基上进行，两个活性位点呈现不对称性。

cryoEM structures reveal distinct asymmetry between FeMoco active sites residing proximally or distally to the docked FeP. These differences include flipping of α-W₂₅₃ in the αβ pair located proximal to bound FeP, and the resultant diversion of a proposed substrate access channel.

晶体结构表明（图2），与FeP结合的MoFeP αβ亚基的构象与游离态不同，这种不对称性与底物通道开闭密切相关。半位点反应模式可能有助于协调两个活性位点的催化步骤，提高整个催化过程的效率。

图2

PSII中Q_A向Q_B转移电子的构象门控机制

PSII的研究揭示了跨膜电子传递的动态调控机制。综述重点介绍了初级醌电子受体Q_A向次级醌电子受体Q_B转移电子的构象门控过程。

多项实验表明，Q_A向Q_B的电子传递存在温度依赖性，表明存在构象门控：

A clear dependence of the ET rate on osmolality was observed, while the reaction was observed to be independent of viscosity. These experiments revealed that conformational changes controlling ET lead to an increase in exposed protein surface area, estimated as comprising ≥800 Ų.

分子动力学模拟和谱学分析发现（图5），这一过程涉及Q_B结合位点附近的动态水网络和氢键网络重排，从而调节质子转移通道：

MD simulations suggest that the exit of reduced Q_BH₂ causes the helix near the Q_B binding site to turn into a loop, forming a pathway for re-protonation of H₂₁₅. This transformation of the helix also leads to loss of S₂₆₄···H₂₅₂ H-bonds, shutting off the pathway for protonation of Q_B during turnover.

这一机制有助于理解PSII如何利用蛋白质构象变化精确控制跨膜电荷分离，实现水氧化和质体醌还原的耦合。

图5

RNR中电子/质子转移路径的关键残基动态

综述介绍了RNR中长程PCET途径的研究进展，特别是对途径中关键酪氨酸残基构象变化的新认识。

对野生型和突变型RNR的EPR光谱研究发现，PCET途径中间的Y₇₃₁可以采取两种截然不同的构象（图7b）：

These two conformations, termed 'flipped out' and 'stacked', appear to modulate the O–O distances between redox active Y residues depending on whether forward or reverse PCET is in process. The flipped out conformer has a short Y₃₅₆-Y₇₃₁ O–O distance of 3 Å and a longer Y₇₃₁-Y₇₃₀ distance. Conversely, the stacked conformation has Y₇₃₁-Y₇₃₀ π–π stacking and shortens their O–O distance to 3 Å, lengthening the Y₃₅₆-Y₇₃₁ O–O distance to 8 Å.

这种动态结构变化有助于调控PCET在正、逆方向上的速率，维持催化循环的定向进行。Y₇₃₁的两种构象在RNR催化中可能具有不同的功能。

冷冻电镜结构进一步揭示（图6），底物结合引起RNR α、β亚基的动态互作，从而引发PCET途径中一系列精细的构象变化，驱动Y₁₂₂自由基向活性位点移动，启动催化。

图6

图7

图7c描绘了实验测定的RNR活性超分子复合物中PCET反应的热力学轮廓，揭示了其需克服约4.6 kcal/mol的能垒。综合这些信息有助于从原子-分子层面理解RNR独特的长程自由基转移机制。

总结与展望

综上，本综述系统梳理了金属酶中质子耦合电子转移与蛋白质构象调控之间的内在联系。一方面，酶分子的整体构象变化（如亚基互作、结合界面重排等）引发关键辅因子和催化残基的微环境扰动，驱动电子/质子转移；另一方面，电荷转移事件也反过来影响蛋白质的结构动力学，实现催化循环中构象与化学变化的互反调节。多学科研究手段的创新应用（如自由基捕获、超快动力学检测、XFEL晶体学等）正在揭示越来越多的调控细节。展望未来，深入理解金属酶独特的构象门控策略有望启发高效人工催化剂的设计，实现可控、可逆的电荷转移调控。这一领域的进一步发展需要化学、物理、生物学等学科的交叉融合和协同创新。

对未来发展趋势的判断和预测

综述作者对PCET构象门控研究的发展趋势做出了一些重要判断:

1. 利用X射线自由电子激光等新技术,实现对PCET驱动的快速构象变化的直接观测和动态示踪,将成为重要方向。

2. 理论计算与先进的光谱学方法结合,阐明构象门控的热力学和动力学机制,特别是对协同PCET过程的构象依赖性的定量描述,是该领域的重要挑战。

3. 金属酶PCET构象门控蕴含的催化策略和设计原则,有望应用于人工催化剂的设计,实现高效、高选择性的催化转化,这将是一个重要的应用方向。

The multiple turnover kinetics and active site re-reduction dynamics are complicated and dependent on the relative concentrations of various protein and substrate components present within the cell. All of this choreography is directed by regulatory allosteric sites that control (1) activity, via either ATP binding to enable the active quaternary structure, or deoxyATP (dATP) binding to drive formation of the inactive α4β4 quaternary structure, and (2) specificity, wherein complementary nucleoside triphosphates direct the specificity of reaction towards their partner nucleoside diphosphate substrates.

这些设想对于理解酶催化机制、设计高效仿生催化剂具有重要的启示意义,为学科发展和产业应用带来新的机遇。

对感兴趣读者的启发和建议

对于对该领域感兴趣但缺乏背景的读者,本综述有以下几点值得关注:

1. PCET是许多重要生物化学过程的核心,构象门控是金属酶实现高效PCET的关键机制。很多重要的金属酶如固氮酶、光系统II、核糖核苷酸还原酶等都采用这一策略,值得深入理解其分子机制。

2. 半位点反应性,PCET过程中的"回填"机制,动态质子通道的调控作用,局域和长程协同PCET过程等,是金属酶构象门控的几个重要特征,对酶催化策略的理解很有启发。

3. 将X射线自由电子激光、超快光谱等新技术与理论计算相结合,有望实现对酶催化过程中快速构象变化和PCET偶联的直接观测,是一个值得关注的研究方向。

4. 金属酶PCET构象门控体现的分子机器协同工作原理,对于合理设计高效仿生催化剂具有重要借鉴意义,是该领域未来的一个重要应用方向,对相关产业发展可能产生重要影响。

通过对这些关键问题和未来趋势的把握,将有助于读者比较全面地认识PCET构象门控研究的重要意义、研究现状、关键科学问题和应用前景,对于理解酶催化化学、开发生物启发的催化技术具有重要启发意义。

Biosyn导师：Lisa Olshansky

https://experts.illinois.edu/en/persons/lisa-olshansky

Lisa Olshansky教授是一位才华横溢的年轻学者,目前在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系任职助理教授。她的求学之路颇具传奇色彩:从圣地亚哥城市学院起步,转学至加州大学圣地亚哥分校并以最高荣誉毕业,随后作为国家科学基金会和总统研究生奖学金获得者前往麻省理工学院深造,师从著名无机化学家Daniel G. Nocera教授,研究金属酶中质子耦合电子转移反应的构象门控机制,于2015年获得博士学位。此后,她又在加州大学欧文分校进行了博士后研究,2018年加入伊利诺伊大学化学系。

Olshansky教授的研究兴趣集中在生物启发的无机化学领域,特别关注金属复合物在构象变化诱导下的性质调控及其在人工金属酶、生物医学和可再生能源等方面的应用。她的实验室主要从事两方面的研究:一是合成可发生诱导构象变化的仿生金属辅因子,二是构建基于蛋白质骨架的人工金属酶。通过引入刺激响应性基团,实现金属离子配位构型和二级配位球的动态调控,进而改变金属辅因子的氧化还原电位、酸碱度、自旋态和底物活化能力等内禀性质,最终实现如生物成像、药物递送和太阳能燃料生产等功能。

Olshansky教授以酶催化剂的构象门控机制为灵感,力图理解和模拟生物系统利用结构变化实现能量转换和耦联催化的精妙策略。她领导的课题组采用合成化学、物理化学和生物化学等多学科交叉手段,致力于在分子水平模拟酶催化过程,并将其应用于能源和生物医学等领域。Olshansky教授的研究视角独特,将无机化学与生物学巧妙结合,充分体现了学科交叉的创新理念。

作为一名年轻的PI,Olshansky教授已经在无机化学和生物无机化学领域崭露头角,发表了一系列高水平论文,并获得了多项荣誉和奖励,如ACS Irving S. Sigal博士后奖学金等。她也一直热衷于教书育人,指导学生开展科研工作。相信在Olshansky教授的带领下,她的课题组将在人工模拟酶催化体系构建方面取得更多原创性成果,为推动人工光合作用和生物医学诊疗技术的发展做出重要贡献。