旧文我们曾介绍过马丁发现在IVT反应过程中，高浓度的RNA产物3'末端发生回折，与自身的上游序列形成发卡结构，同时重新与RNA聚合酶结合成复合物，转录出更长的RNA，从而形成副产物dsRNA。dsRNA会引起强烈的天然免疫反应，是我们体外制备mRNA时严密控制的参数。尽管，目前也出现一些去除dsRNA的方法，例如，突变T7RNA聚合酶，纤维素纯化等方法，但是，效果还是欠佳，所以，我们应该从dsRNA合成的源头上想办法。
IVT产物RNA与RNA聚合酶的重新结合依靠的是一种非特异性的静电相互作用。因此，人们就想提升IVT反应缓冲液中的离子强度，减少RNA产物与聚合酶的重新结合，从而减少RNA产物的自我延伸。马丁实验室观察到处于延伸状态的T7 RNA聚合酶复合物对于盐浓度较为耐受，相反，T7 RNA聚合酶与启动子结合的过程对盐浓度极为敏感，提升盐浓度会导致整个RNA产量发生普遍下降。
马老头子也挺固执的，他就想搞清楚在高浓度盐离子条件下，如何做才能在不影响RNA产量的情况下，减少IVT副产物dsRNA的形成。功夫不负有心人，一个非常有意思的现象出现在老头子眼皮底下：要是让模板DNA双链中的非模板链发生部分缺失或者留个缺口，那么DNA双链中的模板链上的启动子区域和RNA聚合酶之间的结合亲和力将会得到极大提升，更重要的是体外转录反应的启动也会变得对高盐耐受，从而抑制自我延伸dsRNA副产物的形成，使得整个IVT反应的RNA产量和纯度得到提升[1]。
生命不止，老马的折腾也就不会停下来。他在 T7 RNA 聚合酶的 N 末端添加 Strep-tag II 多肽标签，并且在DNA双链非模板链的5’末端添加生物素，最后，将两者与Strep-TactinXT 包被的磁珠共同孵育，形成栓系体外转录体系。在高盐下(0.3M NaCl)拴留转录系统可显著提升正确长度的RNA产量和纯度，抑制自我延伸的dsRNA副产物形成[2]。
然而，由于生物素与Strep-TactinXT 结合强度不够（非共价结合），每次洗涤会造成栓系转录体系活性的丢失，从而限制重复使用的次数。2024年7月16日，马丁实验室又在Nucleic Acids Research上发表文章：A new approach to RNA synthesis:
immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase，他们对栓系体外转录体系做出升级，将HaloTag 结构域与 RNA 聚合酶的 N 末端融合，然后将DNA模板偶联到HaloTag结构域，从而在T7 RNA聚合酶和DNA模板之间建立了共价偶联，再将DNA模板链的另一生物素化的末端连到链霉亲和素包被的磁珠上。
未栓系的IVT体系对盐浓度非常敏感（0.1M NaCl），而游离或者固定于磁珠上的栓系IVT体系表现出对高盐的耐受（0.3M NaCl）。为了从溶液中去除未完全偶联到启动子区域的游离RNA聚合酶，老马丁将整个栓系复合物固定于磁珠上，然后清洗掉游离的RNA聚合酶。经过洗涤的固定栓系IVT体系即便在低盐浓度条件下，自我延伸的dsRNA副产物也显著减少，同时，并不会对正常长度的RNA产量造成影响。我们可以看出来一旦T7 RNA聚合酶靠近DNA模板启动子区域会对RNA产物与T7 RNA聚合酶的结合造成碾压性的优势，使RNA产物无法再进行自我延伸。
对于T7 RNA聚合酶和DNA模板处于游离状态的IVT体系来说，转录可以从DNA模板上不同的启动子区域启动。一旦把T7 RNA聚合酶栓在DNA模板上的特定启动子区域，即便还有其他的启动子，但转录会优先从栓系T7 RNA聚合酶的启动子处启动（无论是低盐浓度，还是高盐浓度）。
在上面的转录反应中，均是合成几十bp的RNA，那这种栓系转录体系是否可以合成更长的RNA呢?研究人员成功采用该栓系体系合成出长度为961bp的NLuc mRNA，无论是使用UTP还是甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸均可得到相似的产量和纯度。并且，研究人员在不纯化去除dsRNA的情况下，将栓系体系合成出的NLuc mRNA转染HEK293细胞，结果发现荧光素酶活性与转录反应中添加的IVT体系中盐浓度有关。NLuc mRNA的细胞内表达水平会随着盐浓度的增加（0.1~0.3M NaCl）而增加，这是因为随着盐浓度的增加，IVT体系中dsRNA产量降低，其触发的天然免疫反应也显著降低。
既然T7 RNA聚合酶和模板DNA均被固定在磁珠上，那么肯定可以反复进行多批次生产。用固定在磁珠上的栓系IVT体系合成NLuc mRNA，每次反应完成后，清洗掉缓冲液成分和NTPs，可重复使用。马丁进行了22轮合成，RNA产量和纯度的批间一致性很强。
小结：
马丁开发了一种固定于磁珠上的栓系体外转录平台，将T7 RNA聚合酶栓系在DNA模板上的启动子区域，避免IVT产物RNA重新与T7 RNA聚合酶结合，从而抑制自我延伸的dsRNA副产物形成。这种栓系IVT体系不仅可用于较长RNA的合成，还可重复使用，进行多批次RNA合成。目前，在mRNA疫苗原液生产中，通过发酵方式生产质粒DNA模板的方式非常麻烦，极其繁琐，涉及发酵、碱裂解、澄清、超螺旋质粒三步纯化、线性化模板制备过程。在旧文中，我们曾介绍过Touchlight公司开发的一种新颖的酶法合成DNA技术—Doggybone DNA，能省去细菌发酵过程。马丁这项工作为我们提供了另外一个思路，将质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶固定下来，多次使用，这应当成为未来mRNA原液生产技术革新的新方向。
参考文献：
[1] High-salt transcription from enzymatically gapped promoters nets higher yields and purity of transcribed RNAs
[2] High-salt transcription of DNA cotethered with T7 RNA polymerase to beads generates increased yields of highly pure RNA
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