近日，环码团队参与开发的猴痘混合环状 RNA 疫苗研究以期刊预校样（Journal Pre-proof）的形式出现在 Molecular Therapy 杂志上面：Circular RNA Vaccines against Monkeypox Virus Provide Potent Protection against Vaccinia Virus Infection in mice (点击文末阅读原文获取)。去年的旧文曾对候选猴痘 mRNA 的开发做过梳理，详细的背景这里不再做阐述。
环码这项研究选择了 4 种猴痘病毒抗原，分别是 A29L，A35R，B6R，M1R。各字合成相应的 CircRNA 以后，采用 ALC-0315-LNP 包封或者将 4 种组分等比例混合后再用 ALC-0315-LNP 包封制成混合 CircRNA 疫苗。
与安慰剂对照组相比，4 种单价 CircRNA 疫苗（5ug）均能在小鼠体内触发相应的血清结合抗体，而 circMix4 混合疫苗(每种组分 5ug)可触发靶向 4 种抗原的血清结合抗体。有意思的是，只有 circMix4 混合疫苗和 circM1R 疫苗免疫小鼠血清中含有较高水平的靶向 VTT 天花毒株和猴痘活病毒的中和抗体滴度，这说明 M1R 抗原主要与中和病毒相关。
猴痘环状 RNA 疫苗在小鼠体内触发强烈的体液免疫
与安慰剂对照组相比，环状 RNA 疫苗小鼠的脾脏细胞，在相应抗原肽的刺激下，可分泌特异性的细胞因子。相比较而言，circMix4 混合疫苗免疫小鼠中分泌特异性细胞因子的脾脏细胞比例水平更加显著。而且，在 A35R 多肽刺激下，circMix4 混合疫苗和 circA35R 疫苗可明显触发 CD8+T 细胞反应，特别是分泌 IFN-γ和 IL-4 的 CD8+T 细胞。
猴痘环状 RNA 疫苗在小鼠体内触发强烈的细胞免疫
与安慰剂对照组相比，只有 circA29L 免疫小鼠的体重出现持续下降。在攻毒试验第七天时，circA29L 免疫小鼠死亡率为百分之百。相比之下，其他环状 RNA 疫苗免疫小鼠在整个试验期间均展现出完全的免疫保护效果。
大体来看，与安慰剂对照组相比，环状 RNA 疫苗免疫小鼠肺部、气管及鼻甲中的病毒载量均出现极其明显的降低。尤其是，circMix4 混合疫苗免疫小鼠的各个测试组织中的病毒载量均得到完全抑制。从肺部组织切片来看，circMix4 混合疫苗的保护效果是最佳的。
猴痘环状 RNA 疫苗的免疫保护效果
一句话来说，这项研究开发的猴痘环状 RNA 疫苗在小鼠体内触发强烈的体液免疫和细胞免疫，并且可保护免疫小鼠免受猴痘病毒的攻击感染。而且，他们还将 4 种编码不同抗体的 circRNA 等比例混合成功制备了混合环状 RNA 疫苗，触发最有效的免疫保护效果。
抛开这些积极的免疫结果，我们最感兴趣的是环码团队采用的环化工艺。据文章显示，他们使用的环化方法是共转录环化，4 种 circRNA 环化效率大致在 60%-70%之间。行业内的朋友肯定知道，环码生物的核心技术是一种基于 group II intron 的环化 RNA 构建策略，号称可实现环形 RNA 的高效工业级生产，相比业内通行的连接酶或 PIE 连接法具有显著优势。
环码生物公司官网展示的技术路线
MIT Daniel. G. Anderson 通过工程化改造鱼腥藻（Anabaena）I 型内含子实现了体外长编码 RNA 的环化，在镁离子和 GTP 存在下，发生两次酯交换反应，形成环状 RNA。由于体外转录反应体系中存在镁离子和 GTP，因此，即便是基于 group I intron 的环化 RNA 环化策略，在体外转录反应中，也是边转录边环化。也就是说，IVT 反应产物中存在一定比例的 circRNA。此外，Anderson 还在文章中提到 2 种提升环化效率的方法：
第一种：IVT 反应结束后，在 DNase I 处理完成后，加入 2mM GTP 在 55℃条件下反应 15min。
第二种：IVT 反应结束后，将纯化得到的 RNA 重新环化。先将纯化 RNA 进行变性处理（70℃加热变性 5min，冰浴 3min），再加入 2mM GTP +10mM 镁离子，继续在 55℃条件下反应 8min。
环化效率提升的关键在于环化策略的选择和序列的优化设计。基于具有自我剪切活性的内含子的环化策略，要想实现工艺生产上的突破性，必须保证体外转录反应产物中拥有极高比例的共环化 circRNA，这样将会避免后续复杂的重新环化步骤。
circRNA 工艺生产中，除了环化效率的提升，第二个难点在于如何从环化产物中特异性地纯化富集得到 circRNA。在环化产物中存在的杂质主要有：precursor RNA、NickedRNA、掉落的 Introns 及多聚体等。常规做法是加入 RNase R 将所有的线性 RNA 消化掉。但是，RNase R 并非是一个特异性特别强的酶，当酶切反应的时间过长或者酶量多时，RNase R 也会消化 circRNA。尽管在科研级别的 circRNA 制备中，经常使用 SEC-HPLC 来分离环化产物中的各个组分，但是，这种方法显然无法将其放大工艺级大规模生产中。
在猴痘混合环状 RNA 疫苗制备中，环码团队使用 ZYMO Research 的 RNA Clean and Concentrator 试剂盒对 IVT 产物进行粗提，以去除多余的 NTP 和转录缓冲液中的盐。为了得到纯度较高的 circRNA，他们首先使用 SEC-FPLC 来去除掉 IVT 产物中的多聚体和小 RNA 片段；接着，使用亲和层析去除掉 precursor RNA 和掉落的 Intron RNA；最后，采用 RNase R，去除掉 Nick RNAs。大家可以发现，环码团队在分离 circRNA 与 precursor RNA/ Intron RNA 时使用了亲和色谱，但是并未指出具体的配基，这一步正是纯化的关键所在。
环码生物自成立以来，一直是国内环形RNA疫苗行业的领航者，持续被资本重仓押注。即便在去年融资寒冬的情况下，环码依然拿到数千万美金的A轮融资。而且，与制药巨头辉瑞和百时美施贵宝分别签订环状RNA的研发合作协议。尽管目前并未有环形RNA管线获批临床，但是，我们相信在不久的将来，环码定会在环形RNA疫苗领域厚积薄发，突破重重关隘，扬帆启程。
相关阅读
CEPI提供九千万美元支持，BioNTech启动猴痘mRNA疫苗临床试验
甘露糖修饰脂质纳米颗粒表面，构建淋巴结靶向性circRNA疫苗平台
VLP递送Tornado系统表达的circRNA,实现更长久的蛋白表达
Orna Therapeutics公布环形RNA平台研发进展
