近日，康德赛与四川大学华西第二医院|华西妇产儿童医院李沁桐等人合作共同在 Molecular Therapy Methods & Clinical Development 发表文章：Macrophage manufacturing and engineering with 5’-Cap1 and N1-methylpseudouridine-modified mRNA，他们开发了一套高效的 GMP 级别治疗性巨噬细胞生产流程，并且采用 mRNA 技术成功在巨噬细胞内表达功能蛋白，增强其吞噬能力，修复损伤肝脏组织。更加重要的是，为满足 NMPA 对体外生产细胞产品的监管要求，他们利用各种检测手段分析终产品巨噬细胞的表型和功能，尤其是基于单细胞测序技术和流式细胞仪鉴定终产品中的细胞组成，为巨噬细胞大规模制备的质量控制和分析提供了宝贵经验。同时，也说明采用 mRNA 技术离体改造巨噬细胞，使其功能更加多样化，是肿瘤治疗和组织修复非常有效的治疗手段。
巨噬细胞的来源和表型
巨噬细胞几乎在存在于所有器官中，以细胞清道夫的名声为人所熟知。事实上，巨噬细胞是一种具有多种功能的天然免疫细胞，在防御病原体入侵、组织发育及稳态维系方面发挥着必不可少的作用。
巨噬细胞有两种来源：
第一，在胚胎发育早期，源自卵黄囊（yolk sac）的红髓祖细胞(erythromyeloid progenitor cells)在发育器官中分化为组织驻留巨噬细胞（RTMs）。
第二，骨髓造血干细胞分化为单核细胞（monocytes）并进入血液系统。单核细胞离开血液进入组织中分化为单核-巨噬细胞（Mo-macs）。
巨噬细胞具有高度的可塑性，会随着外部环境信号的变化，迅速改变其表型。M1 和 M2 是最为常见的两种巨噬细胞表型。M1 巨噬细胞是促炎表型，参与 Th1 型免疫反应及抗肿瘤反应，相反，M2 巨噬细胞则与抑制炎症、组织修复相关。在体外，经常用集落刺激因子（CSF1）诱导单核细胞分化为巨噬细胞，但是，CSF1 诱导的巨噬细胞表现为免疫抑制状态，称为 M(CSF1)。在体外培养过程中，添加 IFN-γ，M(CSF1)极化为促炎 M1 表型，相反，添加 IL-4或者M(CSF1)极化为抗炎 M2。
巨噬细胞—免疫治疗的理想靶标
很多实体瘤微环境中存在大量广泛浸润的、免疫抑制性的巨噬细细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），是肿瘤或者基质来源的趋化因子募集单核细胞分化而来。巨噬细胞具有双重性：一方面，TAM 会通过分泌促生长因子和血管生成因子促进肿瘤生长和转移；另外一方面，巨噬细胞又会发挥吞噬作用、细胞毒性、分泌促炎因子和向 T 细胞呈递抗原，促进适应性抗肿瘤免疫反应。
巨噬细胞是免疫治疗的理想靶标。研究人员开发各种小分子药物和抗体直接清除 TAMs、阻断募集单核细胞产生 TAMs 或者增强抗体介导的吞噬作用。然而，由于 TAMs 的复杂性和异质性，这些方法在临床试验中很难发挥效果。另一方面，过继性基因修饰/改造巨噬细胞疗法逐渐兴起，用于治疗癌症和组织损伤修复。2020 年，Carl H.June 在 Nat.Biotechnol 发表文章：Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy，他们采用腺病毒载体对人巨噬细胞进行基因工程化改造，使其表达嵌合抗原受体，制备了一种持续性的促炎表型的 CAR-Ms。在两种实体瘤异种移植小鼠模型中，单次注射 CAR-Ms 可降低肿瘤负荷并延长总生存期。CAR-Ms 展现出多种活性，包括表达促炎细胞因子和趋化因子，将 M2 巨噬细胞可转化为 M1，增强调抗原呈递，募集和呈递抗原到 T 细胞，并抵抗免疫抑制细胞因子的作用。在人源化小鼠模型中，CAR-Ms 进一步被证明可以诱导促炎肿瘤微环境并增强抗肿瘤 T 细胞活性。
巨噬细胞生产工艺
细胞治疗产品的制备工艺指从供者获得供者细胞到细胞成品输入到受者体内的一系列体外操作的过程。GMP 级别巨噬细胞（Mo-Mac）生产流程大体分为三个部分：收集 PBMCs，富集单核细胞，巨噬细胞分化，成品检测与放行。富集单核细胞可采用 CD14 抗体磁珠纯化亲和纯化或者连续逆流淘析法。采用 CD14 抗体包被的磁珠分离到的单核细胞纯度（＞95%）要比淘析法（＞70%）分离到的更高，然而，单核细胞属于非增殖性细胞，使用抗体磁珠富集大量的单核细胞会导致高昂的费用，因此，采用基于离心力的淘析法更加节省成本。
工序 1: 白细胞分离术采集 PBMCs—粗纯
利用 Spectra Optia system 血液分离设备的 MCN 程序从供者外周血中分离 PBMCs，作为起始材料，此过程称为白细胞分离术（leukapheresis）。
解释一下，为什么叫白细胞分离术？leukapheresis 是由两部分词组成：Leukocytes 指的是白细胞，而 Apheresis 指代的是单采术，也就是利用一个人的血液通过设备进行处理，以分离出特定成分并将其余部分返回到血液循环中。外周血中存在三种类型的细胞：白细胞，红细胞和血小板（没有细胞核）。将白细胞中的粒细胞（拥有多叶核）去除掉以后，剩余细胞组成 PBMCs，全称为外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell）。PBMCs 由拥有单个圆形细胞核的血细胞组成，包括淋巴细胞、单核细胞(monocytes)，树突细胞。所以这一步虽然叫做白细胞分离术，但是收集上收集的是 PBMCs。
工序 2: 连续逆流淘析法富集单核细胞—精纯
利用 Elutra system 基于连续逆流淘析原理从 PBMCs 起始材料中富集单核细胞。在设备中预先灌满含 1%人白蛋白的 Hanks 平衡缓冲液后，将 PBMCs 起始材料泵入到恒定离心速度旋转的淘析室（chamber），并且逐步提升培养基流速，整个淘析持续时间为 1h。朝外的离心力使得细胞远离旋转轴，而培养基流速驱动细胞靠近旋转轴，在双重力的作用下，细胞根据大小和密度逐渐分离为六个不同的组分。大多数情况下，单核细胞富集在组分 4/5/6 中，
工序3:刺激单核细胞分化为巨噬细胞
在 TexMACS (Miltenyi)培养基中添加 M-CSF(100ng/mL)，将单核细胞（1×10^6^ cell/mL）培养 7 天。分别在第 2 天和第 4 天，用新鲜培养基更换掉 1/2 体积的旧培养基。第 7 天，将单核细胞分化的巨噬细胞从培养袋中移出至含有 0.5%人白蛋白的 PBS/EDTA 缓冲液。最终，将离心收集到的细胞重悬于 CS10 细胞冻存培养基中。
巨噬细胞的质量监控与放行检测
NMPA 指导原则（细胞治疗产品质量管理指南和细胞治疗产品研究与技术指导原则）对制备过程中的细胞进行质量监控，中间样品的质量检验与终产品放行检验相互结合与互补，以达到对整体工艺和产品质量的控制。质量研究应涵盖细胞特性分析、功能性分析、纯度分析和安全性分析等方面，并且根据产品的自身特性可再增加其他相关的研究项目。
检测中间样品，比较富集效果
ABX Pentra 60 用于检测分析巨噬细胞生产过程中间样的细胞组成。基于白细胞分离术收集到的 PBMCs 样品的单核细胞比例中位数为 21%，经 Elutra system 逆流淘析进一步富集的样品中单核细胞比例中位数为 73.5%。
形态学分析
在显微镜下，终产品中的巨噬细胞形态呈现圆形，细胞质呈现经典的短突出。
表面标志物表达分析
单抗 25F9 被广泛用来鉴定巨噬细胞，因为它能够与单核-巨噬细胞表面表面的特异性抗原结合。此外，巨噬细胞还会表达 CD14 和 CD206。因此，采用流式细胞仪对终产品进行免疫表型分析。在 23 批巨噬细胞终产品中，25F9+细胞中位比例为 95.3%，而 CD206+细胞中位比例为 93.3%。
功能性分析与细胞存活率
利用 pHrodo E. coli BioParticles 检测巨噬细胞吞噬活性，细胞吞噬 BioParticles 后,pHrodo 染料会在酸性的溶酶体内发出荧光,可通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到。具有吞噬活性的巨噬细胞在最终产品中占到 63%。基于 CD45 的流式检测终产品的细胞存活率为 94.1%。巨噬细胞产量同初始培养的单核细胞数量呈正比。
单细胞测序/流式鉴定细胞类型（纯度）
NMPA 要求鉴定终产品中的细胞组成。使用单细胞测序技术分析来自两个供体的巨噬细胞终产品，结果显示，占据主导的细胞类型为巨噬细胞（97.86%和 98.09%），其他类型的细胞分别为 T/NK 细胞，B 细胞，造血干细胞（HSC）以及中间体细胞（Pro）。研究人员还发现巨噬细胞高表达 CD68/163/206。在来自供体 3 的巨噬细胞终产品中检测到高表达的 CD3D，这说明存在过量 T 细胞。虽然过量 T 细胞的存在并未影响到巨噬细胞的制备和最终的细胞状态，然而，回输含有过量 T 细胞的巨噬细胞产品可能会带来安全隐患。在单细胞水平，通过检测促炎和抗炎标记物表达模式可分析巨噬细胞的细胞状态，结果显示体外制备的巨噬细胞大部分处于未极化状态。最后，研究人员还用流式验证了单细胞测序的细胞组成鉴定结果。
采用 mRNA 技术工程化改造巨噬细胞
采用 mRNA 技术在巨噬细胞中表达功能蛋白能够增强巨噬细胞功能。乙酰氨基酚（APAP）是一种广泛使用的解热镇痛药，但过量摄入可能导致急性肝损伤甚至肝衰竭。在APAP诱导的小鼠肝脏损伤模型中，最为典型的病理特征是大量肝脏细胞的死亡和巨噬细胞的耗竭。增强巨噬细胞的吞噬能力或许有助于清除坏死或者凋亡的细胞，从而加速肝脏的再生恢复。将编码增强巨噬细胞吞噬功能的蛋白的 mRNA 电转至体外制备的巨噬细胞中，检测 mRNA 改造巨噬细胞吞噬死亡哺乳动物细胞的能力，结果发现电转 CD300LF mRNA 的巨噬细胞吞噬能力显著增强。在 APAP 诱导的肝损伤小鼠体内静脉注射 CD300LF mRNA-巨噬细胞，可显著降低肝脏细胞的死亡，血液中 ALT（丙氨酸氨基转移酶）和 AST（天冬氨酸氨基转移酶）水平也显著降低，坏死区域也更小，表明损伤的肝脏功能得到恢复。
小结
这项工作的重点在体外巨噬细胞的大规模制备和质量检测，最后顺带验证了一下利用 mRNA 技术离体改造巨噬细胞的可行性。需要注意的是，这项工作将 mRNA 递送至胞内采用的是电转，电转会造成 50%巨噬细胞死掉，伤亡惨重。为啥没有采用腺病毒载体呢？生产 CAR-M 的腺病毒载体会导致巨噬细胞持久维持促炎表型，这样有利于抗肿瘤免疫反应，然而，对于组织修复来说，抗炎 M2 表型显然更适合。巨噬细胞疗法的关键在于对其进行基因修饰/改造以增强其生物学功能，mRNA-LNP 技术无疑是最为快速有效的一条路。相比体内原位改造巨噬细胞，利用已经成熟的体外巨噬细胞 GMP 级别生产流程，加上高效的 mRNA 递送技术，离体制备出治疗性巨噬细胞，再回输至病人体内无疑是现阶段过渡的更加安全有效的治疗手段。
