增强吸入式mRNA疫苗抗原表达和黏膜免疫反应的UTR序列设计
文摘
2024-10-08 01:19
上海
开发吸入式 mRNA 疫苗是预防呼吸道传染性病原体的有效策略。通过呼吸道免疫机体，不仅可触发全身性免疫反应，诱导分泌血清中和抗体，而且还诱导黏膜免疫反应，从而增强 mRNA 疫苗的保护效力。目前，已上市的或者绝大多数在研的预防性 mRNA 疫苗仍然以肌肉注射免疫途径为主，免疫宿主后，mRNA 疫苗表现出较低的肺部可达性和高度集中的肝脏趋向性，无法建立有效的呼吸道黏膜免疫。mRNA 疫苗由两部分组成：mRNA 分子和递送系统。当前，对于吸入式 mRNA 疫苗的开发集中在优化递送系统，开发以 LNP 为递送系统的吸入式制剂面临诸多困难，例如，雾化过程中产生的强大剪切力、转染支气管上皮细胞需要穿越黏液层、肺上皮细胞紧密连接的基底层等。极少人会去思考 mRNA 分子本身是否会对吸入式 mRNA 疫苗的免疫效力产生显著影响，例如，序列设计，纯度等。近日，莫尼黑大学 LMU 儿科系/重庆第三军医大学国家免疫生物制品工程技术中心关山教授、莫尼黑大学 LMU 儿科系 Joseph Rosenecker 课题组 Xiaoyan Ding，重庆科技大学化学化工学院裴叔宸等人共同在 bioRxiv 发表文章：Airway applied IVT mRNA vaccine needs specific sequence design and high standard purification that removes devastating dsRNA contaminant，他们发现，与肌肉注射免疫途径相比，mRNA 分子本身的质量，特别是序列设计和纯度，会对吸入式 mRNA 疫苗的抗原表达水平和触发的免疫反应产生重大影响。mRNA 纯度对于疫苗免疫效力的影响符合我们一贯的认知：mRNA 纯度越高，dsRNA 含量越少，抗病毒炎症反应越弱，抗原表达水平越高，诱导的体液、细胞及黏膜免疫反应就会越强。最为引入关注的是，这项研究首次发现，相比于肌肉注射免疫途径，UTR 序列对于吸入式 mRNA 疫苗触发的黏膜免疫居然会产生显著影响，并且经过筛选和修饰，设计了一种非常适合黏膜免疫 mRNA 疫苗的 UTR 序列—TB-Opti。本期内容，我们主要介绍 TB-Opti 优化设计过程，希望对业内从事吸入式 mRNA 疫苗或者药物开发的朋友有所启迪。5'/3'UTR 序列对于 mRNA 的翻译表达过程发挥十分关键的作用，因此，合理设计优化 UTR 序列可增强吸入式 mRNA 疫苗抗原表达效率。由于吸入式 mRNA 疫苗是肺部组织中表达抗原，因此，这项研究的主线思路是筛选优化肺部组织各种细胞类型中表达最为丰富的 mRNA 的 UTR 序列。研究者利用生物信息学的方法，对呼吸道相关的细胞中（从肺 DC 细胞到支气管上皮细胞）的 mRNA 丰度进行排序，并且从中挑选出在所有细胞类型中均持续表达的 10 个基因。然后，将这些基因的 5'/3' UTR 序列与萤火虫荧光素酶 CDS（Fluc）组合，体外转录生成 Fluc mRNA，转染呼吸道相关细胞（16HBE，DC2.4，RAW264.7），检测不同 UTR 介导荧光素酶表达水平。结果发现，源自 TMSB10 基因的 UTR 序列介导 Fluc mRNA 的荧光素酶表达水平是最高的。通常认为，MicroRNA（miRNA）靶向 3'UTR 来降低基因表达水平，因此，需要去除掉 TMSB10 基因的 3'UTR 内部的潜在 miRNA 靶点。与原始 TMSB10 UTR 序列相比，去除掉 miRNA 靶点的 UTR 序列（TMSB10'）能够将 Fluc mRNA 在 16HBE 细胞中的表达水平提升 1.5 倍、在 DC2.4 细胞中的表达水平提升 6.2 倍。为更进一步提升 TMSB10' 介导的 mRNA 翻译效率，研究者选择在 UTR 序列中插入经典的功能性 motif。第一个基序为 Apt-eIF4G，是可招募 eIF4G 的适配体，已证实将其插入 5'UTR 序列可提升 mRNA 翻译效率。另外一个是 R3U 基序，源自 Sindbis 病毒 RNA 区域，负责结合 RNA 结合蛋白，增强病毒 RNA 基因组稳定性。在 TMSB10' 序列中，无论是单独插入还是组合插入 Apt-eIF4G 或者 R3U，均可显著提升蛋白翻译表达水平，但是，插入 Apt-eIF4G+R3U 组合对于蛋白翻译水平的提升最为显著，将该优化后的 TMSB10' 序列称为 TB-Opti。与 Moderna mRNA1273 UTR 序列（MDN）或者 BioNtech BNT162b2 UTR 序列（BNT）相比，TB-Opti 介导的 EGFP mRNA 翻译水平显著增强。采用吸入途径进入小鼠体内的 Fluc mRNA-LNP，TB-Opti 介导的 Fluc mRNA 表达的荧光信号在小鼠体内或者肺部组织均显著要高于 BNT 介导的，相比之下，采用肌肉注射途径进入小鼠体内的 Fluc mRNA-LNP，TB-Opti 和 BNT 介导的 Fluc mRNA 在在小鼠体内或者肝脏、脾脏组织中产生的荧光信号未表现出现显著差异。TB-Opti/BNT RBD mRNA LNP 采用肌肉注射途径或者吸入途径免疫小鼠，观察不同注射途径下 UTR 序列对于 RBD mRNA 触发的免疫反应的影响。采用吸入式免疫途径时，TB-Opti 诱导产生的 RBD 特异性血清 IgG 水平明显高于 BNT 诱导的，相比之下，采用肌肉注射免疫途径时，TB-Opti 和 BNT 诱导的 RBD 特异性血清 IgG 水平无显著差别。此外，只有采用吸入式免疫途径时，才会在肺泡灌洗液或者洗鼻液中检测到 RBD 特异性 sIgA，并且，TB-Opti 诱导的 sIgA 要明显高于 BNT 诱导的。采用吸入式免疫途径时，TB-Opti 免疫组肺部淋巴细胞分泌的 IFN-γ和 IL17-A 明显高于 BNT 免疫组；采用肌肉注射免疫途径时，TB-Opti 免疫组和 BNT 免疫组两者脾脏细胞分泌的 IFN-γ无明显差异。这项发现表明只有采用吸入式免疫途径时，TB-Opti 才会提升 RBD mRNA 疫苗的免疫效力，充分说明特定的 mRNA 序列设计对于通过气管接种的 mRNA 疫苗的必要性。
这项研究最为值得借鉴的地方是如何筛选设计 UTR 序列来增强 mRNA 在特定组织中的表达，并且，可将该研究得到的最优 UTR 序列—TB-Opti 推广应用到更多的吸入式 mRNA 疫苗或者药物中。![]()
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