所谓一步法共环化，指的是在体外转录反应体系中，由于存在 GTP 和 Mg2+，因此，从线性化模板转录形成的 precusor RNA 会紧接着发生环化反应，从而使得 IVT 反应产物中存在一定比例的 circRNA。多数情况下，在 IVT 反应结束后，我们会选择再进行一轮额外的环化反应。重新环化的反应体系和条件为：在收集纯化的 IVT 产物中添加 2mM GTP 与 10mM Mg2+；55℃，加热 8min。这样做的目的是让残留在 IVT 产物中的 precusor RNA 能更好地环化为 circRNA，进一步提升环化效率。
测定不同温度下野生型（WT）T7 RNA Polymerase 的催化活性。随着 IVT 反应温度从 37°C 升高到 50°C，T7 RNA Polymerase 酶活性迅速下降。T7 RNA Polymerase-WT 在 45°C 时的比活力仅为 22.09 ± 3.7 U/μg，比 37°C 时的原始比活力低 10 倍以上。因此，37°C 是野生型（WT）T7 RNA Polymerase 合成 RNA 的最适温度，但是，最适 IVT 反应温度要远远低于重新环化的温度（55℃）。
采用毛细管凝聚电泳分析 37℃反应合成的 IVT 纯化产物中各组分比例，结果显示，在 IVT 纯化产物中，precursorRNA 与 circRNA 占比各为 50%左右。于是，有人怀疑在 IVT 产物中之所以存在这么大比例的 precursor RNA，可能是 37℃对于自剪接环化反应来说温度太低。
有人提出一种假设：将 IVT 反应直接在 55℃反应是不是会得到足够高比例的 circRNA，从而省去重新环化的步骤，只用一步共转录便可得到高产量的 circRNA。然而，要实现这种高温 IVT 一步法环化策略首先得保证 T7 RNA Polymerase 在高温下的具有稳定的催化活性。
近日，南京诺唯赞与南京林业大学叶建仁课题组合作在 Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 发表文章：Effective synthesis of circRNA via a thermostable T7 RNA polymerase variant as the catalyst，他们通过筛选耐受高温的突变 T7 RNA Polymerase，仅仅采用一步高温 IVT 反应（50℃）便可高效生产 circRNA，环化效率超过 95%，同时还可将 dsRNA 含量降低至少 20%，极大地简化了基于 I 型内化子的 PIE 环化工艺。
首先，他们选择以往研究中筛选确定的与 T7 RNA Polymerase 高温稳定性相关的一系列点突变(S430P, N433T, S633P, F849I, F880Y)，构建初始版本的耐高温 T7 RNA Polymerase 突变体 M0。M0 在 45℃条件下的比活力可到达 430.95 ± 5.15 U/μg，要比野生型 T7 RNA Polymerase 比活力高出 19 倍。随着温度继续提升，M0 比活力骤降；在 50℃条件下，M0 比活力基本消失。
一般来说，氨基酸对蛋白稳定性的贡献越大，那么在进化中将会越保守，因此，用保守性氨基酸替换非保守性氨基酸可能会使得蛋白突变体更加稳定。此外，蛋白稳定性还更自由能相关，自由能越低，蛋白越稳定。通过生信分析，研究人员选择 C530S 和 G788A 作为潜在的突变位点。结果发现，M0+G788A 要比 M0+C530S 在高温条件下（＞45℃）具有更高的比活力。
研究人员测定不同 T7 RNA Polymerase 突变体在不同温度下采用一步法合成 RNA 的产量。在 37℃条件下，IVT 反应 90min，野生型 T7 RNA Polymerase RNA 产量为 197.3 ± 17.38 μg；在 50℃条件下，M0+G788A RNA 产量为 192.6 ± 16.2 μg。也就是说，随着温度的升高，T7 RNA Polymerase 突变体的 IVT 产量并未发生显著变化。
采用毛细管电泳检测 IVT 产物，野生型 T7 RNA Polymerase IVT 产物中的 precursor RNA 与 circRNA 占比各为 50%，形成鲜明对比的是，M0+G788A 突变体IVT产物中precursor RNA 占比降低为 4.5 ± 0.28%，也就是说超过 95%的 precursor RNA 直接在 IVT 反应过程中环化为 circRNA。此外，研究人员还发现，随着 IVT 反应温度的提升（37~50℃），IVT 产物中的 precursor RNA 比例出现显著下降。
在 IVT 反应中，高温可减少通过 3’末端延伸回折形成的 dsRNA 含量，但是，不会影响依赖反义链合成的 dsRNA 含量。在 circRNA 合成过程中，同样也是产生 dsRNA。研究人员发现，随着温度的升高，M0+G788A 突变体 IVT 合成反应产物的 dsRNA 也会随之发生显著下降（仅为 37℃时 IVT 产物总 dsRNA 含量的 20%）。
小结
这项工作开发了一种耐高温的 T7 RNA Polymerase 突变体（M0+G788A），使得高温（50℃）一步法合成 circRNA 变成可能。随着 IVT 反应温度的升高，更多的 precursor RNA 环化为 circRNA，而且，dsRNA 含量也发生显著下降。在高温条件下，保证 T7 RNA Polymerase 酶活不发生下降的情况下，凭借 IVT 反应一步生成 circRNA，将会极大地简化 circRNA 合成工艺。
