6月25号，石药开发的基于mRNA-LNP技术的CAR-T细胞注射液，顺利拿到新药临床批件。最近，在BioRxiv上看到一篇复旦大学基础医学院璩良等人上传的预印本文章：Synergically enhanced anti-tumor immunity of in vivo CAR by circRNA vaccine boosting，很好地处理了抗原呈递细胞、T淋巴细胞及肿瘤细胞之间的关系，通过注射编码特异性CAR肿瘤抗原的circRNA疫苗增强circRNACAR介导的巨噬细胞和T淋巴细胞的抗肿瘤效应。
璩良师从魏文胜，2022年以共同一作的身份在Cell发表过一篇文章：Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants，相信业内不少人看过。
本期内容，我们就以璩良等人最新的研究内容为主线，展开聊聊基于mRNA技术的CAR-T、CAR-M细胞疗法。
嵌合抗原受体（CAR）T细胞是一种创新的癌症免疫疗法，已有多款CAR-T上市产品成功治疗某些类型的血液癌症，尤其是B淋巴细胞瘤。然而，体外制备工程化改造的T细胞成本极高、步骤繁琐，人们开始使用mRNA-LNP技术在体内原位生成CAR-T细胞或者CAR-M细胞。
2020年，在人类白血病、前列腺癌和乙型肝炎诱导的肝细胞癌的小鼠模型中，华盛顿大学生物工程系M. T. Stephan等人定期重复注射CAR/TCR-mRNA注射液，使得体内T细胞瞬时表达CAR或者TCR抗原受体，实现有效的抗肿瘤反应。T. Stephan选择可生物降解的聚（β-氨基酯）（PBAE）阳离子聚合物作为CAR/TCR-mRNA递送载体，聚合物颗粒表面有偶联CD8抗体的负电性的聚谷氨酸（PGA），使得聚合物脂质纳米颗粒具有T细胞靶向性。
心脏纤维化是心脏组织变硬和形成疤痕的过程，后果可能是致命的。T细胞和一小部分B细胞中表达CD5分子。成纤维活化蛋白FAP是化成纤维细胞的标志物。Drew weissman等人向体内注射FAP CAR-mRNA LNP(CD5靶向性)，可显著减少心脏纤维化并恢复损伤后的心脏功能。
在肝癌组织（HCC）中，GPC3（细胞表面蛋白聚糖）和CD24（抗吞噬信号蛋白）的表达均出现上调，CD24与巨噬细胞表面表达的抑制性受体唾液酸结合Ig样凝集素G（Siglec-G）相互作用，可激活基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIMs），限制巨噬细胞的吞噬功能。山东大学药学院蒋新义团队制备了一种由嗪衍生的可离子化脂质体组成的肝脏巨噬细胞靶向性LNP，向体内递送GPC3 CAR mRNA和Siglec-GΔITIMs mRNA。缺乏ITIMs的Siglec-G可识别并竞争性地结合HCC细胞的CD24，躲开ITIMs的激活，从而抑制肝癌细胞发出的“不要吃我”信号通路，最终增强CAR-Ms介导的细胞吞噬作用和抗原呈递。在HCC小鼠模型中，这种治疗策略可提升肝脏吞噬细胞的吞噬能力，减轻肿瘤负荷，增加小鼠存活时间。
脓毒血症是一种感染引起的严重全身性炎症反应，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的持续感染和宿主免疫抑制是造成脓毒血症相关死亡的主要原因。金黄色葡萄球菌表面蛋白A（SasA）是识别金黄色葡萄球菌的显著靶标。CASP11（炎症性半胱天冬酶-11/半胱天冬酶-4）抑制线粒体活性氧介导的杀伤，使得MRSA在巨噬细胞中长期存活。蒋新义团队采用内源性富马酸衍生的新型可电离脂质材料YHS-12组成的LNP ，同时又在脂质纳米颗粒表面引入巨噬细胞靶向肽CRV，向体内巨噬细胞靶向性递送SasA CAR-mRNA和CASP11靶向性siRNA，从而增强体内巨噬细胞的吞噬作用，防止MRSA发生免疫逃逸，已达根除MRSA的疗效。
相比线性mRNA，circRNA更加稳定，能够表达更加持久，更多的CAR蛋白，从而有可能发挥更加高效的抗肿瘤免疫反应。人类表皮生长因子受体II（HER2）是一种在多种肿瘤组织中过度表达的酪氨酸激酶受体促生长蛋白。璩良等人基于I型内含子设计合成编码HER2特异性CAR蛋白的circRNA Anti-HER2-CAR。虽然circRNA Anti-HER2-CAR在HEK293细胞中表达水平很高，但是它在T细胞和巨噬细胞中产生的CAR蛋白水平要低得多。于是，他们对circRNA CAR序列进行密码子优化，选出在T细胞和巨噬细胞中表达量最高的circRNA CAR-opt-3 。将转染circRNA Anti-HER2-CAR的 Jurkat细胞（一种永生化的人T细胞）、THP-1细胞（一种永生化的人巨噬细胞）或J774A.1（一种永生化的鼠巨噬细胞）分别与不同类型的肿瘤细胞根据不同比例孵育，转染circRNA Anti-HER2-CAR的T细胞或者巨噬细胞可显著杀伤多种类型的肿瘤细胞，并且呈现剂量依赖效应，说明circRNA CAR 可以介导T细胞和巨噬细胞发生有效的体外肿瘤杀伤活性。
此外，在肿瘤微环境中，巨噬细胞可以极化为两种相反的状态—促炎状态或抗炎状态。circRNACAR 转染的 J774A.1 或 THP-1 细胞表现出促炎极化—诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平升高，与炎症相关的信号通路得到增强。
接下来，最为关键的问题是如何在体内高效地将circRNA CAR递送至T细胞和巨噬细胞？脾脏主要由T细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞组。璩良等人筛选出一种脾脏靶向性LNP。在小鼠模型中，静脉注射LNP-circRNA Luciferase，发现荧光素酶主要聚集在脾脏中，而不是肺或者肝脏。肿瘤微环境含有大量肿瘤相关巨噬细胞、T细胞和树突状细胞。将LNP-circRNALuciferase 局部注射到皮下荷瘤小鼠的肿瘤中，荧光素酶主要集中在局部肿瘤区域。此外，他们还证实脾脏靶向性SORT-LNP 也可实现circRNA Luciferase肝脏靶向性表达和瘤内表达。
那么，circRNA CAR 是否可以抑制体内肿瘤生长？在具有正常免疫功能的CT26-HER2结直肠癌小鼠模型中，当CT26-HER2肿瘤体积达到约50∼80 mm 3时，静脉注射15 μg SORT-LNP-circRNA CAR显著抑制CT26-HER2肿瘤生长。当皮下CT26-HER2肿瘤体积达到约50∼80mm3 时，瘤内注射4次15 μg SORT-LNP-circRNA CAR，明显降低肿瘤负荷并延长小鼠存活时间。在4T1-HER2乳腺癌或者MC38-HER2结肠直肠癌小鼠模型中，瘤内注射SORT-LNP-circRNACAR可实现类似的抗肿瘤效果。总的来说，这些结果表明基于circRNA的体内原位生成CAR在治疗实体瘤方面具有可喜的疗效。
实体瘤通常是难治性的，部分原因是免疫抑制性的肿瘤微环境。circRNA CAR 可以在 MC38-HER2 和 CT26-HER2 结直肠癌小鼠模型中将肿瘤微环境重塑为高度促炎状态，促进CD8 + T 细胞和促炎 CD86 + 细胞的浸润。
璩良等人通过RNA-seq分析发现circRNA CAR 的抗肿瘤作用可能与B细胞反应有关，考虑到抗体介导的ADCC或者ADCP效应，加之有研究已经证实Car疫苗可提升CAR-T细胞抗肿瘤效应，那自然就想探索circRNA疫苗是否能协同增强circRNACAR 可的抗肿瘤免疫力？
我们先回顾一下CAR疫苗增强CAR-T细胞抗肿瘤效应的一些研究：
在血液瘤中，恶性肿瘤B细胞可作为抗原呈递细胞，为CAR T细胞提供强大的增殖信号。然而，一旦到了实体瘤环境下，肿瘤特异性的细胞表面靶标数量有限，CAR T细胞与肿瘤细胞的接触又不是很通畅。即便CAR T细胞遇到靶标分子，由于免疫抑制微环境，使得CAR T细胞严重缺乏增殖信号，所以，CAR T细胞的数量会迅速下降。这时候有人提出一种策略：如果让APC细胞表面充分表达CAR靶标，是否可为同源的CAR-T细胞提供增殖信号呢？
2019年，Science有篇文章采用一种淋巴结靶向性的白蛋白结合磷脂聚合物作为递送载体，将CAR配体（小分子、多肽及蛋白结构域）连接到聚合物尾部，从而使得CAR配体能够呈现在抗原呈递细胞表面，与共刺激信号分子共同作用，提升CAR-T细胞增殖能力，创造出了一种CAR-T细胞加强疫苗，在多种实体瘤模型中增强CAR-T细胞的抗肿瘤效应。2020年，BioNtech在Science发表篇文章也证实小鼠静脉注射CLDN6 RNA-LPX疫苗（CARVac）增强CLDN6-CAR-T 细胞的扩增。
璩良等人设计了一款编码人HER2融合蛋白的circRNA VAC疫苗，采用EABR domain和EPM motif替代HER2原有的胞内domain，目的是提升诱导的HER2抗体滴度。在HEK293T细胞中，circRNA VAC 表现出HER2-EPM-EABR融合蛋白的高效跨膜表达，同时上清液中也有高效分泌的HER2-EPM-EABR囊泡。CT26-HER2结直肠癌的小鼠模型中，静脉注射或者瘤内注射circRNACAR ，同时肌肉注射circRNA VAC疫苗，与单独注射circRNA CAR 或者circRNAVAC疫苗相比，两者共同注射展现出更好的肿瘤抑制效果和更长久的小鼠存活时间。
小结
与过继CAR-T细胞疗法相比，基于mRNA技术的体内CAR-T细胞疗法成本低、现货、无需骨髓清除、可重复注射以及无需担心基因组整合风险。无论是瘤内还是静脉内注射，circRNA疫苗均可协同提高基于circRNA的体内CAR的抗肿瘤免疫力，为实体瘤的治疗提供了新思路。这种治疗策略在概念验证上是成功的，然而，面临两个非常棘手的问题：
第一，circRNA的大规模制备工艺还未彻底打磨好。由于环化反应中生成的诸多副产物，circRNA纯化工艺一直没有一个非常简单、高效的方法。这大概也是国内circRNA公司还迟迟未拿到IND批件的原因。
第二，如何靶向性递送circRNA CAR至T淋巴细胞或者巨噬细胞。尽管有许多靶向性LNP的早期研究发表，但是，经过大规模验证的非肝靶向性LNP还未出现。
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