PolyA 尾缩短是细胞 mRNA 降解的关键步骤，并且 PolyA 尾对于帽依赖性翻译是不可或缺的。在最为广泛的帽依赖性翻译机制模型中，真核生物翻译起始复合物由识别帽结构的 eIF4E、解开 5'UTR 二级结构的 eIF4A 以及充当支架蛋白的 eIF4G 组装完成。PABPC 可识别结合 PolyA 尾巴，并且同 eIF4G 发生相互作用，使得 mRNA 首尾互连，形成闭环。PABPC 具有双重作用，一方面与翻译起始复合物结合启动翻译，另外一方面遮盖 PolyA 尾部。以防止脱腺苷化反应，延长 mRNA 半衰期。
鉴于内源性去腺苷化机制依赖于 3' →5' 核酸外切酶复合物，并且去腺苷化是细胞内 mRNA 衰变的限速步骤，那么，我们对 PolyA 尾巴序列加以修饰，使其变得耐受核酸酶，保证PolyA 序列完整性和功能，理论上就可提升 mRNA 半衰期，从而增加其蛋白表量。
mocRNA—酶法合成与有机合成的完美结合
2022 年，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所王潇团队曾经在 ACS Chemical Biology 发表文章：Chemically Modified mocRNAs for Highly Efficient Protein Expression in Mammalian Cells，他们构建了一种新颖的 mocRNA，将化学合成的修饰寡核苷酸与 IVT 合成的 mRNA 桥接起来，以保护 PolyA 尾巴免于降解，同时，又不影响翻译能力。令人兴奋的是，3' 末端含有硫代磷酸酯 (PS) mocRNA 在 HeLa 细胞中的蛋白质产量增加 2-4 倍，在原代大鼠皮质神经元培养物中的蛋白表达量增加 10 倍。
在 mocRNA 中，修饰寡核苷酸包括以下结构：
在寡核苷酸 5'末端，存在一个 5'磷酸基团+至少 6 个 A。通过 T4 RNA 连接酶，IVT-mRNA 3'末端将会与寡合酸 5'磷酸基团形成磷酸二酯键。
为防止寡核苷酸自连，在其 3'末端存在一个阻断保护基团：ddC（2'-3'-双脱氧胞苷）或者 InvdT（反向 2'-脱氧胸苷）。
中间部分是由修饰核苷酸组成的可变序列，包括硫代磷酸酯(PS) 连接或者 A-G 替换、脱氧腺苷以及源自端粒的 DNA 四链体 。
王潇团队开发的 mocRNA，是一种模块化的合成策略，可以同其他类型的 RNA 修饰联合使用，例如，结合 PABP 的寡核苷酸、耐水解 7-甲基鸟苷帽、修饰的 5' UTR 区域及 mRNA 体内其他类型的修饰核苷酸。mocRNA 将 mRNA 的酶法合成与有机合成整合在一起，能够对 mRNA 进行非常精准的多样化学修饰，极大地改善 mRNA 的稳定性，提升蛋白表达量。
多尾 mRNA 拥有蛋白表达超能力
2024 年 3 月 22 号，王潇团队在 Nature Biotechnology 发表重磅文章：Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA（点击文末阅读原文可获取PDF），他们设计创建了具有多个 PoyA 分支的多尾 mRNA，使得 polyA 尾巴对核酸外切酶具有更强的抵抗能力，从而增加 mRNA 的稳定性，延长蛋白表达时间，提升蛋白表达水平。
多尾 mRNA 由来自 IVT 合成的 mRNA 与化学修饰的多尾寡核苷酸通过 T4 连接酶桥接而成。多尾寡核苷酸具有以下特征结构：
30nt 茎区：在其 5'末端具有 5'磷酸基团，用于后续酶连；内部序列上镶嵌有多个 5-辛二炔基脱氧尿苷分支点(OU)，相互之间间隔 12nt，便于 PABPC 结合，每个分支点可与含有 5'-叠氮化物手柄的 30nt PolyA 分支尾耦合。
30nt PolyA 分支尾：含有 5'-叠氮化物手柄。
在 30nt 茎区和 PolyA 分支尾 5'末端均具有 2'-3'-双脱氧胞苷，用来防止自连；末端的最后 6 个碱基采用硫代磷酸酯(PS)连接，以便阻止去腺苷酸化。
铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）反应中，会产生具有 1~3 个 PolyA 尾分支的多尾 mRNA，可利用 HPLC 将其分离开来。
研究人员将各种不同化学修饰（PS、脱氧核苷及 2'-O-甲氧基乙基修饰（2MOE））和拓扑结构(1~3 个 PolyA 尾分支数量)的寡核苷酸与 IVT-Fluc mRNA 连接，转染 HeLa 细胞，在所有测试的构建体中，构建体 8 表达最强荧光信号，其结构具有 3 个 PloyA 尾分支并在茎和分支尾 PloyA 上协同掺入 2MOE 和 PS 修饰。
采用眼球后静脉注射单剂量 40 μg/kg 的编码分泌型纳米荧光素酶 (NLuc) 的多尾 NLuc mRNA-LNP，从 6 小时到第 2 天，多尾 mRNA 要比未连接的 Mock lig mRNA 对照组发光信号高 3.3-5.0 倍，比无分支的 mod mRNA 高 1.6-2.2 倍。而且，在稍后的时间点检测到显着更高的发光信号，多尾 mRNA 的表达比无分支的 mod mRNA 高 7.5 倍，比未连接的 Mock lig mRNA 高 47 倍。
多尾 mRNA 以最小剂量在小鼠肝脏中对治疗家族性高胆固醇血症的临床相关基因 Pcsk9 和 Angptl3 进行高效多重基因组编辑，即使用 0.7mg/kg 剂量的多尾 Cas9 mRNA 在 Pcsk9 和 Angptl3 基因上分别实现了 46%和 54%的编辑效率，相比较而言，未连接的 Mock lig mRNA 的编辑效率分别仅为 14% 和 6%。Pcsk9 和 Angptl3 血清蛋白水平的下降最终转变为血清中总胆固醇和甘油三脂的下降。
小结
一句话，王潇团队对 PolyA 尾实施化学修饰，改变其拓扑结构，目的是避免mRNA尾巴去腺苷酸化，从而增强 mRNA 稳定性，延长蛋白表达时间，提升蛋白表达水平。这种构想非常新颖大胆，但是，未来要想将其转化应用于mRNA疫苗或者药物中，还需要进一步优化学合成工艺和下游纯化工艺，以确保多尾 mRNA 的关键质量属性和批间稳定性。
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这种多尾 mRNA 的设计，让我想到日本人将一些的短的 dsRNA 连接到 mRNA 上，就像是为 mRNA 序列镶嵌了一排“牙齿”，dsRNA“牙齿”能够激活细胞内的天然免疫受体，充当佐剂，增强 mRNA 疫苗免疫效果。详情见往期内容：PNAS|mRNA序列嵌合dsRNA“牙齿”,增强免疫原性。
真核生物mRNA翻译起始过程，详情见往期内容：改变5'UTR结构，控制翻译效率
我们曾介绍过，一个非常有意思的发现，在巨噬细胞中，转染 24h 时，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列平均延长 20A，能够增加至 200A。到转染 72h 时，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列又重新回到初始的 100A 左右。详情见往期内容：首次发现新冠mRNA疫苗体内聚腺苷酸化，增长PolyA尾巴
