Mike Mitchell 课题组实在是太太太高产了，近日，又在 Advanced Materials发表新作：Antigen Presenting Cell Mimetic Lipid Nanoparticles for Rapid mRNA CAR T Cell Cancer Immunotherapy（点击文末原文链接），他们制备了一种脂质纳米颗粒aLNP，表面偶联有 CD3 抗体片段+CD28 抗体片段。采用aLNP 递送CAR mRNA，一步便可制备CART 细胞，不再需要传统 CART 制备工艺中的磁珠来专门激活 T 细胞。
加速前进的 CART 行业
简单说，CART 细胞疗法，相当于在 T 细胞表面架上了一个精确靶向肿瘤细胞的导航系统，这个导航系统称为嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor）。通常，抗原呈递细胞 APC 需要将抗原肽以 MHC 复合物的形式呈递给 T 细胞，才能激活 T 细胞，而 CART 细胞疗法不再需要 MHC 复合物，借助靶向肿瘤相关性抗原的抗体准确地让 T 细胞捕获并且杀死肿瘤细胞。嵌合抗原受体由三部分组成：胞外区、跨膜区和胞内区域。胞外区通常是单链抗体 scFv，负责识别并结合肿瘤细胞表面的抗原。跨膜区将 scFv 锚定于细胞膜上，而胞内区由 CD3 信号域和共刺激信号域（例如，CD28）组成。
在当前获批的 CART 细胞工艺流程中，需要采用包被 CD3/CD28 抗体的磁珠激活从患者体内分离到的 T 细胞，然后，再使用病毒载体将编码 CAR 的基因构建体整合到 T 细胞基因组中，使得改造后的 T 细胞表面得以表达嵌合抗原受体。最后，再将体外扩增的改造 T 细胞回输患者体内，使其能特异性识别和杀灭肿瘤细胞。
自从 2017 年，首款 CART 药物获批治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病以来，又有五种 CAR T 细胞疗法被 FDA 批准用于治疗血液恶性肿瘤。国内也有 4 款 CART 药物获批上市，分别来自复星凯特、药明巨诺、驯鹿生物以及合源生物。
病毒载体 CAR T 工艺突遭不祥
今年 1 月份，FDA 发布公告：要求所有已获批上市的 CART 药品更换品产品标签，在黑框警告中加上一句话“治疗后可能引发继发性 T 淋巴细胞癌”，给整个 CART 行业带来极大的震荡。究其原因，FDA 怀疑在 CART 药品制备中递送 CAR 基因的病毒载体将自身基因组插入整合到宿主细胞基因组中，一旦插入到基因组上与癌症相关的基因序列附近，可能引发癌变。
其实，一直以来以病毒载体生产的 CAR T 细胞虽然可带来持久的癌症缓解，但是，存在两种非常严重的、常见副作用 ：细胞因子释放综合征和神经毒性。这些毒性一般在 CAR T 细胞给药后几天内出现，使用用白细胞介素 6 受体单抗和皮质类固醇可进行治疗。此外，CAR T 细胞还可在体内持留多年，在患者的肿瘤细胞被清除后还能长久地发挥其靶向作用。在 CAR T 细胞治疗血液恶性肿瘤的背景下，这会导致 B 细胞再生障碍和低丙种球蛋白血症。这些副作用促使人们探索改造 CAR T 细胞工程的非病毒载体方法，例如，将 CAR mRNA 递送至 T 细胞。由于 mRNA 不会整合到基因组中，因此，只会发生短暂的 CAR 表达，这可能有助于预防 CAR T 细胞疗法的长期副作用。自从新冠 mRNA 疫苗的安全性和功效在数亿人群中得到验证以后，越来越多的研究者开始探索将 mRNA-LNP 技术与 CAR T 细胞疗法结合起来，以便更高效地治疗多种癌症。
制备可激活 T 细胞的 aLNP
为离体改造 T 细胞，人们经常使用表面共价偶联有人 CD3 抗体与人 CD28 抗体的磁珠（Human T-activator CD3/CD28 Dynabeads）来模拟 T 细胞激活的过程。在传统的 LNP 给药工作流程中，需要将 T 细胞激活磁珠添加到 T 细胞培养基中。然后，共孵育 24 小时，待 T 细胞激活后，再用磁铁去除激活磁珠，最后，添加 CAR mRNA- LNP。虽然这种策略是有效的，但是这种做法使得工序变得非常复杂耗时，同时在珠子提取过程中还会造成细胞产量的损失。Mike 团队提出了一种构想，将 CD3 抗体+CD28 抗体片段直接连到 LNP 表面，消除了磁珠激活的繁琐步骤，一步便可生产 mRNA CAR T 细胞。
先前有研究发现，LNP 表面上的马来酰亚胺官能团（maleimide）能够结合二硫键还原为硫醇基团的抗体片段。此外，研究者希望通过酶法去除抗体的 Fc 区域，以防止可能出现的负面炎症副作用。
Mike 团队采用 C14-4 可电离脂质、胆固醇、DOPE、PEG 脂质以及锚定有马来酰亚胺官能团的 PEG 脂质制备 LNP，称为 mal-LNP。使用 IdeZ 将人 CD3 和 CD28 抗体酶切为 F(ab') 2 和 Fc 片段，然后，用 DTT 还原 F(ab') 2 上的二硫键为硫醇基团。将切割和还原的 CD3 和 CD28 抗体片段添加到 mal-LNP 中，通过硫醇-马来酰亚胺反应进行表面缀合，产生用于激活 T 细胞的 aLNP。
aLNP 高效转染人原代 T 细胞，无需磁珠活化
由于 T 细胞的激活需要初级激活信号（CD3）和共刺激(CD8)双重信号，在没有激活磁珠的情况下，只有 aLNP（表面偶联有马来酰亚胺官能团+αCD3 抗体+αCD28 抗体） 或 αCD3-LNP + αCD28-LNP 可以有效地将 mRNA 递送至原代人 T 细胞，而 mal-LNP（表面仅偶联有马来酰亚胺官能团的）或αCD3-LNP（表面偶联有马来酰亚胺官能团+αCD3 抗体）或αCD28-LNP（表面偶联有马来酰亚胺官能团+αCD28 抗体）均无法有效转染 T 细胞。
不管是否存在激活磁珠，aLNP 和 αCD3-LNP + αCD28-LNP 之间的荧光信号没有统计学上的显着差异，这表明 无论 CD3 和 CD28 抗体片段是存在于同一个纳米颗粒表面，还是单独的纳米颗粒表面，在促进 LNP 摄取和 mRNA 翻译方面具有相似效果。
令人惊讶的是，采用激活磁珠对 T 细胞进行预处理后，磁珠会结合到脂质纳米颗粒表面，形成空间屏蔽，抑制 T 细胞摄取 aLNP。
总结来说，aLNP 可作为独立的 T 细胞转染试剂，无须磁珠活化。
优化 aLNP 表面的 CD3/CD28 抗体片段比例
研究者采用 aLNP 递送靶向 CD19 的 CAR mRNA，对纳米颗粒表面的 CD3 与 CD28 抗体片段比例进行优化。当 aLNP 纳米颗粒表面的 CD28 抗体片段比 CD3 抗体片段数量更多时，更加有利于 aLNP 将 CAR mRNA 递送进入原代人 T 细胞。
在体外，将表面耦合有不同比例 CD3/CD28 抗体片段的 aLNP-CAR mRNA 转染人原代 T 细胞，然后与表达荧光素酶的 Nalm6 的 CD19 阳性人急性淋巴细胞白血病肿瘤细胞按照不同比例共培养。结果发现，所有类型的 aLNP 生成的 CAR T 细胞均表现出强力、剂量依赖性杀伤。
所选的 aLNP 必须表现出高转染效率，这样才能最大限度地利用有限的患者体内分离的 T 细胞生产 CAR T 细胞。此外，aLNP 对 T 细胞必须没有毒性，所得的 CAR T 细胞将非常有效地杀死肿瘤细胞。考虑到这些参数，研究者选择使用 1:10 aLNP，并且证实 1:10 aLNP 产生 CAR T 细胞的效率与磁珠激活+mLNP 处理组相比是等效的。
采用 aLNP 生出的 CART 细胞，易于增殖，毒性持久，具有激活表型。
在临床上，激活珠不仅可激活 T 细胞，还用有利于 T 细胞扩增。研究者比较 1:10 aLNP 和激活珠介导 的 T 细胞扩增能力，结果发现 1:10 aLNP 可引发更加强劲的 T 细胞增殖。并且，采用 4 天前用 1:10 aLNP 处理的原代人 T 细胞扩增得到的 CAR T 细胞与 Nalm6 肿瘤细胞共孵育，依然可观察到剂量依赖性的细胞杀伤能力。CAR T 与 Nalm6 细胞比例最高时杀伤率为 96.1%，最低时杀伤率为 37.9%。因此，采用 aLNP 扩增的 CAR T 细胞在给药后至少 4 天保持其细胞毒性。
与磁珠 + mal-LNP 转染的 T 细胞相比，aLNP 转染 T 细胞表达更高水平的 CCR7 ，这表明 T 细胞保留了分化程度较低的中央记忆 (CM) 表型，对于输注产品来说是优选的。此外，磁珠 + mal-LNP 转染的细胞群体中具有较高数量的 CD45RA 阳性终末分化 TEMRA 细胞，对于输注产品中是不利的。因此，1:10 aLNPs 完全可用于生产具有理想表型的细胞输注产品。
与未处理组相比，珠子+mal-LNP 和 aLNP 导致 T 细胞表面的 CD25、CD69 和 CD44 明显上调，表明 T 细胞激活。总体而言，磁珠和 1:10 aLNP 对于原代人类 T 细胞来说是类似的有效激活剂。
最后，用磁珠+ mal-LNP 处理的 T 细胞产生更高水平的颗粒酶 B，而用 aLNP 处理的 T 细胞产生更高水平的穿孔素和可溶性 FasL。用磁珠 + mal-LNP 处理的 T 细胞比用 1:10 aLNP 处理的 T 细胞明显表达更多的 TNFα 和 IFNɣ，但是，由于两种类型的 CAR T 细胞具有相同的癌细胞杀伤能力，因此这种差异对治疗功效来说可能不是关键的影响因素。
体内实验
在低白血病负荷小鼠模型中，用 1:10 aLNP 生成的抗 CD19 CAR T 细胞可有效减轻白血病小鼠模型的肿瘤负荷并延长生存期(与 PBS 处理组或者未转染 T 细胞相比，存活天数延长 6 天)。采用慢病毒载体生成的 CAR T 细胞治疗小鼠组比 采用 PBS 治疗的对照组小鼠存活天数延长了 8 天，而 采用 1:10 aLNP 生成的 CAR T 细胞治疗小鼠组比 PBS 组存活天数 延长了 17 天。总结来说，使用 aLNP 生成的抗 CD19 CAR T 细胞的过继转移可减轻白血病异种移植小鼠模型中的肿瘤负担。
小结
Mike 团队开发了一种偶联有 CD3 抗体片段+CD28 抗体片段的 aLNP，无须磁珠，便可激活 T 细胞，一步生成 mRNA CART 细胞，能够在体外有效杀死癌细胞，易于增殖，并且可与磁珠处理生成的 T 细胞表达相似水平的表明激活标记物。最重要的是，这种由 aLNP 产生的抗 CD19 CAR T 细胞过继转移至白血病异种移植小鼠模型中可有效减轻肿瘤负荷，延长生存时间。简而言之，这项研究证实 aLNP 可作为一种 mRNA CAR T 细胞疗法的高效生产平台技术。
