像镰刀状细胞疾病、α/β地中海贫血症等单基因突变血液疾病在婴幼儿中会造成非常高的发病率和死亡率，例如，痛苦的血管闭塞、严重贫血、对致命性感染的易感性增加 ，在某些情况下甚至导致胎儿死亡。
目前，FDA 获批的首款治疗镰刀状细胞疾病和β地中海贫血症的基因编辑药物首先需要分离患者的 CD34+造血干细胞，然后，在体外扩大培养，利用基于 CRISPR 技术的基因编辑恢复血红蛋白的正常表达水平和功能，最后，将经过基因编辑的造血干细胞回输至预先清髓的病人体内。尽管目前离体基因编辑的造血干细胞回输病人体内后展现出来非常不错的治疗效果，但是，这种离体基因编辑治疗流程非常繁琐，费用高昂，无法惠及更多的寻常患者。相反，基于体内的基因编辑疗法可能只需要静脉注射一针基因编辑药物，无须收集和体外培养 HSCs、无须清髓和移植，整个治疗成本将会骤降。
体内基因编辑疗法面临的最大挑战之一就是如何将基因编辑元件准确、高效递送至靶细胞中。当下较为普遍的基因编辑元件递送方法是采用病毒载体或者电穿孔 RNP 复合物，然而，随着脂质纳米颗粒的安全性、高效性、模块化逐渐在大比例人群中得到验证，越来越多的研究者抢先转向开发基于 mRNA-LNP 技术的体外或者体内基因编辑疗法。
具有自我更新和分化能力的造血干细胞 （HSC） 负责维持所有类型血细胞的供应。成人造血干细胞主要位于骨髓的特定微环境中，称为骨髓生态位(bone marrow niche)。静脉注射LNP 要想进入到骨髓中的成人造血干细胞内是极其困难的。有趣的是，胎儿在发育过程中，造血干细胞会驻留在肝脏中。具体来说，胎儿肝脏在妊娠的早期阶段（大约妊娠第 6 周）就开始具备造血功能，并在妊娠 4 至 5 个月时达到造血高峰。在这一阶段，胎儿肝脏中不仅存在造血干细胞，还包括造血祖细胞，这些细胞在肝脏中扩增和分化，生成各种血细胞以维持胎儿的生长和发育。胎儿肝脏的造血功能在妊娠中期逐渐减弱，最终在妊娠晚期由骨髓取代成为主要的造血器官。这种转变确保了胎儿在出生后能够依靠骨髓持续生成血细胞。
考虑到脂质纳米颗粒具有天然的肝脏富集性，宾夕法尼亚大学生物系 Mike 课题组的明星博士生 Rohan Palanki 诞生了一个非常大胆的想法：将编码基因编辑元件的 mRNA-LNP 递送至子宫内胎儿的造血干细胞中，在母体内对患有先天性血液疾病的胎儿实现早期基因编辑干预。
Rohan 解决的首要问题是找到一种可高效转染胎儿造血干细胞的脂质纳米颗粒。
2021 年，Mike 课题组在 Science Advance 发表文章：Ionizable lipid nanoparticles for in utero mRNA delivery，他们构建了一个 LNP 脂质库，通过卵黄静脉注射 Luc mRNA LNP 至妊娠 16 日的小鼠子宫内胎儿体内，筛选到一种可高效转染小鼠胎儿肝脏的可电离脂质 C14-490。按照 1mg/kg 卵黄静脉注射剂量，Rohan 往 R26mT/mG双荧光报告基因小鼠子宫内的胎儿体内（E13.5，即胚胎发育 13.5 天）打入 Cre mRNA LNP（C14-490） ，收集注射 60h 后的胎儿组织。一旦成功发生基因编辑，那么细胞表达的 Tomato 红色荧光膜蛋白（mT）将会转变为 GFP 绿色荧光膜蛋白（mG），凭此可判断转染效率。结果显示，C14-490-LNP 在胎儿肝脏细胞中的转染效率可达到 50%，然而，在胎儿造血干细胞中的转染效率只有 2%。也就是说，C14-490-LNP 仅依靠胎儿体内的被动分布，很难在胎儿造血干细胞中实现较高的转染效率。
如何让 C14-490-LNP 主动靶向胎儿造血干细胞？
大家肯定首先想到的是在 LNP 表面偶联上靶向造血干细胞表面受体的抗体。在造血干细胞膜表面表达 CD45 受体（CD45R），因此，Rohan 将 CD45 抗体 F(ab')2片段偶联至 C14-490-LNP 表面。相比于非靶向性 LNP，在一系列表达 CD45R 的免疫细胞中，例如，Jurkat 细胞，CD34+原代人脐带血细胞，CD34+人胎儿肝脏祖细胞等，CD45 靶向性使得 C14-490-LNP 转染效率提升数倍。在不表达 CD45R 的 HepG2 细胞中，CD45 靶向性并不会增强 C14-490-LNP 的转染效率。如果用游离的 CD45 抗体屏蔽掉 Jurkat 细胞表面的 CD45R，那么 CD45 靶向性 LNP 的递送效率将会发生显著下降。此外，在血浆中，CD45 靶向性 LNP 表面形成蛋白冠的种类/含量与非靶向性 LNP 并无差别。总的来说，在细胞水平，CD45 靶向性 C14-490-LNP 会特异性增强其在表达 CD45R 细胞中的转染效率。
命运总是垂青打破常规之人。在 R26mT/mG小鼠模型中，向其子宫内的胎儿体内(E13.5)静脉注射 Cre mRNA C14-490-LNP 制剂，60h 后奇迹发生了，CD45 靶向性 C14-490-LNP 在胎儿造血干细胞中的转染效率（30%）相比非靶向性 LNP（4%）提升将近 10 倍。有趣的是，在成年 R26mT/mG小鼠中静脉注射 CD45 靶向性和非靶向性 C14-490-LNP 递送 Cre mRNA 时，肝脏细胞均展示出显著的、相似的转染或者基因编辑效率，但是，两者在骨髓造血干细胞几乎检测不到转染或者基因编辑发生。
这种子宫内胎儿造血干细胞发生的基因编辑是否具有持久性呢？
在 R26mT/mG小鼠子宫内向其胎儿体内注射 CD45 靶向性和非靶向性 Cre mRNA C14-490-LNP 制剂，待 4 个月后这些胎儿将成长为成年鼠，检测肝脏、骨髓及外周血中基因编辑细胞的比例。在注射靶向性 LNP 的子代成年鼠体内，50%的肝脏细胞发生基因编辑（与注射非靶向性 LNP 的子代成年鼠比例一致），19%的骨髓造血干细胞发生基因编辑（注射非靶向性 LNP 的子代成年鼠仅占 4%）。与此对应的是，由造血干细胞分化而成的一系列造血谱系细胞中存在类似比例的基因编辑细胞，包括 T 细胞、B 细胞、单核细胞、粒细胞及红细胞。最后，这种向子宫内胎儿注射靶向性 LNP 实现基因编辑的治疗手段对于胎儿的出生存活率、肝脏功能及体内细胞因子水平均无显著影响。
判断长期造血干细胞（LT-HSCs）有一个黄金标准：将造血干细胞转移至受到辐射的受体小鼠体内，可长期存活并持续产生各类血细胞。经过 CD45 靶向性 LNP 转染的 R26^mT/mG^小鼠胎儿在经历 4 个月后成长为成年鼠后，将其骨髓转移至辐射受体小鼠体内。移植受体小鼠历经 4 个月后，其外周血细胞和造血干细胞的基因编辑效率仍与供体小鼠相似。
总结来说，这种在子宫内经过基因编辑的造血干细胞无论是在其成长为成年小鼠还是二次移植给供体小鼠，造血干细胞基因组发生的改造修饰将会在其分化的后代细胞谱系中持续存在。
采用 DOE 优化共递送 Cas9 mRNA+sgRNA 的 C14-490-LNP 制剂配方。随着可电离脂质比例的增加或者磷脂、胆固醇及 PEG 脂质比例的下降，C14-490-LNP 介导的基因编辑效率增高。在子宫内递送基因编辑元件至胎儿造血干细胞编辑基因组时，采用筛选到的最佳 LNP 制剂配方制备的 CD45 靶向性 C14-490-LNP（STEM LNP）要比非靶向性 C14-490-LNP 表现出更高的编辑效率。
小结
这项研究为先天性血液疾病提供了一种极为激进的治疗方法：向子宫内胎儿静脉注射编码基因编辑元件的 mRNA-LNP 制剂，借助靶向性 LNP，直接在胎儿造血干细胞中实施基因组编辑，产生具有自我更新和多潜能的长期造血干细胞。这些长期造血干细胞在胎儿发育成长为成年小鼠过程分化形成的一系列造血谱系的后代细胞均可维持长久的基因组编辑，从而对先天性血液疾病患者的造血干细胞突变基因在胎儿期便实现矫正。整个研究 90%的工作内容都在优化 CD45 靶向性 LNP 递送系统，目实现高效的、靶向性的胎儿造血干细胞转染效率，在此基础上才能去进一步优化基因编辑效率。没有出色的递送系统，再有创意的治疗策略也无从谈起。
宾夕法尼亚大学Mike课题组往期文章：
Mike Mitchell课题组 基因编辑LNP制剂工艺开发报告 无需磁珠激活，aLNP偶联信号抗体，一步制备mRNA CART细胞 神奇的高通量LNP筛选平台：双重评估血脑屏障转染与转运 提升可电离脂质递送效率，长尾递送短mRNA，短尾递送长mRNA。 肺靶向性mRNA药物修复病毒感染后的肺血管损伤。
