不过，也有厂商大哥提出批评：你们的文章，虽然基本事实没问题，但是，厚此薄彼，对有些厂商浓墨重彩，对有些厂商一笔带过。这会对读者造成潜在引导，跟你所谓的独立客观相去甚远。这位厂商大哥过于敏感了，应该自信一点。动动脚指头想想，就会明白任何一家企业肯定不会仅靠一篇公众号文章的投票结果来选择关键原料的合作伙伴。至于厚此薄彼的问题，得认真解释一下：有些已经占据绝大部分国内市场的厂商，入局早，市场营销弄得风生水起，于我们而言，找到的信息就会多一些。有些起步晚或者低调闷声发大财的厂商，网上也就没有那么多的宣传信息，我们也很无奈，只能寥寥数笔带过。没有收取任何厂家的广告费，用爱发电，初衷仅仅是让优质国产 mRNA 原料被更多的从业者知晓。
回到本期内容，我们搜集了市面上有能力生产 GMP 级别 T7 RNA 聚合酶的国产厂家，想跟大家聊聊原料酶的那些事。同时，也要再次邀请大家选出自己最钟意的 mRNA 原料酶国产厂商。实在是精力有限，无法将所有相关厂家系数网罗，要有遗漏，还请多多谅解，欢迎大家评论区补充进来。
在 mRNA 原液生产中，除去质粒线性化要到的限制性内切酶，单就体外转录反应（Invitro Transcription）来说，涉及到的原料酶包括：T7 RNA 聚合酶、无机焦磷酸酶、RNase 抑制剂、牛痘加帽酶、Cap 2'-O-甲基转移酶以及消化线性化质粒模板的 DNase I。由于更加简化的工艺，共转录加帽工艺已占据主流，在生产中，大家以后肯定会弃用牛痘加帽酶及 Cap 2'-O-甲基转移酶所代表的酶法加帽工艺。此外，在 circRNA 合成中，还会用到 RNase R，然而，circRNA 合成工艺还不够成熟，因此，这里我们暂不去涉及。总之，T7 RNA 聚合酶绝对是最为关键的 IVT 反应原料。
假如将整个体外转录反应体系视为车辆加工生产间，那么 99KD、单亚基的 T7RNA 聚合酶就如同机械臂一样，以线性化质粒为蓝图，将游离于缓冲液中的单个核苷酸黏合为一条条整装待发的 mRNA 超级战车。在申报 IND 的临床批生产中，最为看重的是 mRNA 原液批间工艺和质量的稳定性，因此，最理想的 T7 RNA 聚合酶一定要面对任何情形均能表现出稳如泰山、八风不动的气质。
这里的“稳”有三层意思：首先，是指 T7RNA 聚合酶具有极强的兼容性。在应对不同序列组成、结构及长度的质粒模板时，酶原料均能展现出稳定输出，合成的 mRNA 产量和质量不会因模板不同而异。第二，从微升反应体系放大至上百升反应体系时，对于 T7RNA 聚合酶来说，毫无波动，产量等比例增加，质量依旧符合标准。最后，还有非常重要的一点，原料酶厂家得有过硬的平台技术，确保供应的不同批次间酶性能不会发生变化，具备大规模生产车间。不然，等到后续商业化生产的时候，中途再去变更原料酶供应商就会带来很多麻烦。
原料酶价格也是疫苗开发者采购考量的重要因素。相比较国外的老牌供应商，例如 NEB，Thermo，Takara 等，国产酶厂家开发的对应产品更具性价比，风险更低。由于各大厂商均没有公开 GMP 级别 mRNA 原料酶的相关价格，我们通过咨询业内朋友及小体积价格估算 IL IVT 反应液的花费大致在一百万左右。考虑到所用 IVT 体系比例的不同，原料厂商所提供的优惠幅度不同，实际总花费会有较大出入。但是，各个组分所占费用比例大致差不多，从中可以清晰看到，T7 RNA 聚合酶要占 IVT 反应总费用的一半。
在 USP 发布的第二版 mRNA 疫苗质量分析方法草案中，与原料酶紧密相关的质量属性包括：序列保真度、序列完整性、加帽率、纯度、dsRNA 含量等。在工艺开发原料筛选阶段，我们无需将草案所描述的质量属性挨个测定，更加关注使用酶合成的 mRNA 产量和纯度。
目前，各家厂商宣传的 T7 RNA 聚合酶的产量大致在 120ug~200ug/20uL 反应体系。要是有厂商宣传他们的 T7 RNA 聚合酶产量能到达 8~10mg/mL 反应体系，你得问问清楚，这个产量是不是通过亲和层析纯化数据计算得到的。因为当我们纯化 100uLIVT 反应体系时，采用的是氯化锂或者 RNA 提取纯化试剂盒。这种纯化方法不具有特异性，纯化后的终产物中存在一些小片段杂质，这些杂质会使 IVT 终产量变得虚高。相反，根据 Oligo dT 亲和层析柱纯化数据计算的 IVT 产量才是真实可靠的，也必然要比你等比例放大氯化锂纯化产量低得多。旧文曾提到过，一般文献报道的 IVT 产量大都在 2~5mg/mL，只有通过补料添加镁离子和核苷酸，才能使得 IVT 产量达到 10mg/mL。
市面上，各个厂商标注的 T7 RNA 聚合酶酶活不尽相同。T7 RNA 聚合酶酶活定义为：在 37℃下，1 h 内使 1 nmol 的 ATP 掺入酸性不溶物的酶量定义为 1 个活力单位（U）。酶活（Enzyme Activity）是指酶催化特定反应的能力，通常以单位时间内转化底物的量来衡量，它是酶催化活性的直接表现，酶活单位用 U 表示。要比较不同厂商 T7 RNA 聚合酶的催化效率，不能用直接用酶活单位去比对，因为单位体积内的酶活高，也可能是含有更多的酶蛋白所造成的。我们需要引入酶的比活（Specific Activity），它定义为单位酶质量（通常以毫克为单位）在单位时间内催化底物转化的摩尔数，单位为 U/mg。比活是酶纯度和功能的一个指标，用于表征同一酶的不同样品或不同酶之间的催化效率。
至于 mRNA 原液中的 dsRNA，并非越低越好，要根据 mRNA 应用场景来说。就疫苗来说，dsRNA 还可充当佐剂，那只要低于行业标准就行，不必追求极致。目前，有文献报道，对于临床应用而言，mRNA 原液中的 dsRNA 含量应该保持在 0.5%以下。某厂商对七家不同厂家 T7 RNA 聚合酶生产的 mRNA 原液进行 dsRNA 含量检测，结果显示这七家酶生产的 mRNA 原液中的 dsRNA 含量在 0.027%~0.0475%。
最后，体外转录反应的缓冲液体系也是极为重要的，其成分包括镁离子、二硫苏糖醇（DTT）或者三烷基膦（TCEP）、亚精胺、Tris-HCl 等。为什么转录缓冲液如此重要呢？一方面，镁离子浓度直接影响产量及 dsRNA 含量，另一方面，缓冲液组分还与沉淀析出有关。我们知道，在体外转录反应中，焦磷酸镁形成后是难以溶解的，所以会加入无机焦磷酸酶，水解焦磷酸。然而，很多时候，即便在体外转录反应体系中存在无机焦磷酸，沉淀照样析出。这种沉淀的形成可能较为复制，与多种因素相关，例如 mRNA-酶复合物，多聚 mRNA-镁离子复合物等。不管怎样，厂商提供的体外转录反应缓冲液必须要确保不能产生沉淀，不然，这种浑浊的样品一旦进入层析柱，会给下游的层析工艺造成严重的挑战。
接下来，我们详细介绍国产 mRNA 原料酶厂商。
苏州近岸
从 2009 年成立至今，近岸（创始人毕业于复旦大学）坚持深耕重组蛋白应用，其主营业务发展为三大块：靶点及细胞因子，重组抗体，酶及试剂。根据 Frost & Sullivan 数据，近岸在国内 mRNA 原料酶及试剂市场国内厂家排名第一，2021 年度占据国内 39.80%的市场份额。2022 年 9 月近岸首次公登录科创板，被誉为国内"mRNA 原料酶第一股"。近岸的上市离不开新冠疫情带来的收入剧增，其中，mRNA 酶原料及试剂占当期主营业务收入比例从 2020 年度的 1.61%骤增至 2021 年度的 37.84%。
图片：公司新冠业务与非新冠业务占比情况，源自苏州近岸蛋白科技股份有限公司首次公开发现股票并在科创板板上市招股说明书（上会稿）
在招股书中，近岸称自 2013 年便重点布局 mRNA 原料酶赛道，于 2020 年正式具备 mRNA 原料酶规模化生产能力。近岸已向国内 100 多家 mRNA 疫苗/药物开发生产客户提供酶原料，例如，沃森生物、石药集团、艾博生物、丽凡达、斯微生物、荣灿生物、康德赛等。在 2021 年，仅沃森生物一家就采购了近亿元的 mRNA 原料酶，这一数值占到公司当期 mRNA 原料及试剂收入比例约为 95%。此外，艾博和石药集团采购金额也超百万元。尽管随着新冠疫情的消散，近岸 2023 年上半年度（1-6 月份）营业收入同比下滑 55%，但在 mRNA 原料酶赛道的老大地位仍然不可撼动。
图片源自：近岸官网 mRNA 原料产品信息
上海恺佧
恺佧生物成立于 2018 年，创始人同样毕业于复旦大学。恺佧给自己的战略定位是新兴治疗领域的关键上游原材料供应商，喜欢攻克别人不敢做、难度高、前沿性、需求未被满足的重组蛋白产品。凭借四次跨膜的 Claudin18.3 一鸣惊人，最近再下一城，恺佧发布了全球首款商业化的 GMP 级碱基编辑酶。
2021 年 10 月份的时候，在共同股东的牵线下，恺佧与艾博牵手合作，将向艾博供应 mRNA 原料酶。此外，恺佧还同具备多年核苷酸研发生产的恒康药业建立了深度战略合作关系，与专心打造 mRNA 疫苗/药物生产线的博腾生物也建立了战略合作。
2022 年 10 月份，恺佧生物完成近 2 亿元的 B 轮融资。距离成立之初仅仅四年的时光，恺佧迅速壮大，已经拥有上万平方米的 GMP 级蛋白酶大规模生产基地。恺佧的 Logo 和网站设计是我们调研的酶原料厂家中做的最前卫现代的，这也从侧面反应出恺佧一个不走寻常路，异常生猛、放眼全球的后起之秀，敢于创新，潜力无限。
图片来源：恺佧生物官方网站：mRNA 体外合成解决方案
武汉瀚海新酶
瀚海新酶成立于 2015 年，致力于成为世界一流的特种酶产品与服务供应商。创始人毕业于吉林大学，现任职于上海交通大学，从事分子酶学与蛋白质工程研究。在核酸原料篇，我们曾特意提到过，瀚海新酶于 2019 年参股武汉糖智药业。2020 年，瀚海新酶的销售额就突破 1 亿元，并且，在 2021 年，瀚海新酶 C 轮融资达到近 8 亿元的巨额投资。
瀚海新酶主营业业务为体外诊断试剂，公司总客户的 2/3 均为 IVD 行业，在生物制药领域算是刚刚迈入。然而，凭借多年特种酶开发领域积深厚的技术底蕴，瀚海新酶很快就与浙江海昶生物达成合作，为期提供体外转录反应的原料，助力其新冠 mRNA 疫苗项目拿到 FDA 的新药临床试验批件。未来，在 mRNA 疫苗原料赛道，瀚海新酶就如同其公司 Logo 一样，定能厚积薄发，扬帆远航。
图片来源：瀚海新酶官方网站：mRNA 药物完整解决方案
南京诺唯赞
诺唯赞成立于 2012 年，十二年的时光，已让诺唯赞为医药研发者所熟知。其创始团队成员大多来自南京大学，公司主攻生物试剂与体外诊断产品。新冠疫情的全球范围爆发扩散，使得诺唯赞 2020 年的主营收入较 2019 年全年增长 483.48%，最终，在 2021 年 11 月登录科创板，上市成功。看到 mRNA 赛道的无限潜力，诺唯赞也早早开发出一系列 GMP 级别的体外转录反应的酶体系，成为国内 mRNA 原料供应商中极具实力的一支力量。
图片来源：诺唯赞官网体外转录原料
上海翌圣
2014 年，翌圣在张江药谷落地生根，多年来专注于分子生物试剂的开发。如同诺唯赞一样，相信，大家对翌圣家的产品也非常熟悉。2021 年底，翌圣投资 5500 万在武汉光谷产业园新建占地 5400 平米的 mRNA 疫苗原料生产基地，快速布局 mRNA 疫苗/药物原料供应链。目前，翌圣也早已完成 mRNA 原液生产相关的 GMP 级别产品开发。不走运的是，翌圣在今年 3 月份被迫终止科创板 IPO。好事多磨，只要潜心打磨提升自身的产品，迟早会走到敲钟的那一刻。
图片来源：翌圣生物官网
珠海宝锐
宝锐生物成立于 2012 年，是一家专注于生物医药产业上游领域的国家高新技术企业。2023 年 10 月，宝锐生物开发的 T7 RNA 聚合酶与 RNase R 酶原料完成 FDA DMF 备案。
图片来源：宝锐生物官网
杭州珲信
珲信生物位于杭州，属于华东医药旗下全资子公司。其珲信依托华东医药研发平台，可提供 mRNA 体外合成的核苷酸原料和酶原料。其官网备案域名审核通过日期是 2023 年 4 月 10 号，算是 mRNA 原料赛道背景强大的新入局者。
图片来源：珲信生物官网：mRNA 体外合成酶原料
上海乐布斯
去年，在朋友圈刷到一篇文章：乐布斯开发 T7 RNA 聚合酶专用体系，称其是国内首家 T7 RNA 聚合酶药品 GMP 级别合规供应商。据其官网显示，乐布斯主营业务是生物制药下游层析工艺产品的开开发，并且，授权经营瑞普利金全系列工艺产品，例如，TFF 设备、膜包、中空纤维柱、层析系统等。有意思的是，这样一家以代理仪器为主营业务的公司竟然也满怀信心杀入 mRNA 原料供应的角斗场，勇气可嘉。
北京同立海源
北京同立海源生物成立于 2011 年，是一家专注细胞和基因治疗（CGT）上游 GMP 级原料试剂研发及生产的企业，拥有 GMP 级洁净车间，主打产品是细胞分选磁珠。2021 年 12 月 16 日，在其官方微信公众号发布 GMP 级 T7 RNA 聚合酶新品。
广州新百泰
广州新百泰生物，成立于 2009 年公司官网介绍其是一家致力于生物制药领域关键原材料，特别是酶制剂研发及生产的高科技企业，拥有上万平方米的 GMP 生产车间。2022 年 9 月，新百泰微信公众号介绍了其自主研发的 T7 RNA 聚合酶。其官网公开的产品少的可怜，除了 T7 RNA 聚合酶，就只有全能核酸酶与 CRISPR-Cas9 两种产品。
小结
目前，mRNA 疫苗体外转录反应原料供应赛道竞争异常激烈。早入局者已经把市场吃光，留给新来的厂商机会很少。各家生产的原料酶质量接近，疫苗开发者更看重的是性价比和供应商积累的声誉实力，尤其是那些已有成功申报 IND 客户的原料酶厂家在市场中的地位只会越来越稳固。新人要出头，只能提供差异化的产品或者服务，才能一点点虎口夺食，比如，有的厂家可以将 T7 RNA 聚合酶、RNase 抑制剂、无机焦磷酸酶制备成混合酶体系，甚至将质粒线性化的内切酶也加入混合酶体系，简化工艺步骤。这些 mRNA 行业内的国产原料厂家不仅将原料价格给打下来，而且，还凭借自身强大的研发平台，开发出一系列的 mRNA 质量检测试剂盒。希望未来原料厂家与药企、Biotech 互生共赢，携手推进国产 mRNA 疫苗的飞速发展。
