免疫检查点阻断剂是当前癌症治疗的主要手段之一，遗憾的的是，仅有少数癌症患者对免疫检查点阻断有反应。T 细胞炎症性肿瘤或者‘’热”肿瘤预示着免疫治疗的成功，而非炎症性肿瘤或者“冷”肿瘤一般对免疫治疗表现不佳。抗原呈递对于产生靶向肿瘤的 T 细胞反应极为关键，然而，冷肿瘤存在抗原呈递方面的缺陷。因此，要想诱导出抗肿瘤的 T 细胞反应就要矫正冷肿瘤抗原呈递方面的缺陷。
DC 细胞是先天免疫和适应性免疫反应的关键桥梁。肿瘤组织经常通过各种方式抑制 DC 细胞反应来实现免疫逃逸，例如，抑制 DC 细胞分化或者成熟。重新激活 DC 细胞有助于重启冷肿瘤免疫反应。目前，也存在许多 DC 靶向性的抗体药物，最为有名的是 CD40 激动剂。由于它们能够将免疫学上的“冷”肿瘤变成“热”的肿瘤，因此在癌症治疗方面显示出巨大的前景。
除了 DC 靶向性的抗体药物，研究人员还开发了基于 DC 细胞的治疗性肿瘤疫苗。Sipuleucel-T（商品名：普列威）是一种针对晚期前列腺癌的基于 DC 细胞的自体细胞免疫疗法，是 FDA 批准的首款治疗性疫苗（2010 年）。前列腺酸性磷酸酶（PAP）是一种前列腺抗原，在大约 95%的前列腺组织中表达。将 PAP 羧基端与 GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）氨基端融合，形成 PAP-GM-CSF 融合蛋白。采用该融合蛋白在体外激活分离自病人的树突状细胞，再将其回输至患者体内，可高效激活 T 细胞反应，杀死体内的前列腺癌细胞。
过继性 DC 细胞疗法有 3 个非常关键的地方：第一，找到特异性的肿瘤抗原；第二，采用何种方式将抗原装载到 DC 细胞上；第三，在注射到病人之前确保激活 DC 细胞。从以上三个方向出发，我们还需要对基于 DC 细胞的治疗性肿瘤疫苗做出更多的改进。最近，人们开始利用 mRNA-LNP 技术表达抗原诱导肿瘤特异性免疫反应的疫苗，采用的给药途径涉及肌肉注射、肿瘤内或静脉注射。虽然局部注射 LNP 制剂通常是安全且可耐受的，但由于在较高浓度下或重复注射时会产生肝毒性，使得全身静脉给药可能更具挑战性。
当然，也有人开发体内 DC 靶向性的 LNP，在不影响治疗效果的情况下，减少使用剂量。清华大学化学系喻国灿团队采用甘露糖修饰的可电离脂质分子(Man-lipid)制备了一种 DC 细胞靶向性的脂质纳米颗粒递送系统 STLNPs-Man，可与 DC 细胞表面高表达的甘露糖受体发生特异性结合。有趣的是，STLNPs-Man 还能通过阻断 CD206/CD45 信号来下调 CTLA-4 表达，从而进一步增强抗肿瘤免疫力。
肿瘤内 NK 细胞以及其他的淋巴细胞分泌趋化因子（如 XCL1 和 CCL5），募集 cDC1s（传统 1 型树突状细胞 ）到肿瘤微环境中。NK 细胞进一步分泌生长因子 FLT3L 不仅有助于 cDC1s 存活，还会增强 DC 前体分化为局部的 cDC1s。在肿瘤内，cDC1s 会摄取肿瘤细胞释放的一些物质，并且特异性地将肿瘤抗原转运到引流淋巴结，然后呈递给 naive CD8+ T 细胞，使其激活、增值、分化为细胞毒性效应 CD8+ T 细胞。此外，肿瘤微环境中的 cDC1 分泌的趋化因子 CXCL9/10 还会将引流淋巴结中的 CD8+ 效应 T 细胞募集到肿瘤组织中，并且可以局部呈递肿瘤抗原以重新刺激募集的 T 细胞。最后，cDC1 分泌的细胞因子（如 IL-12）还会进一步增强肿瘤内 T 细胞和 NK 细胞的抗肿瘤活性，而 T 细胞和 NK 细胞分泌的 IFN-γ又会反过来刺激 cDC1 的增值。虽然 DC 细胞在肿瘤免疫控制中发挥着极其关键的作用，但是，肿瘤细胞会通过各种策略抑制 DC 细胞的发展以实现免疫逃避。这样的话，对于免疫系统受到抑制的癌症病人来说，很难通过直接的抗原肿瘤疫苗接种来诱导有效的抗肿瘤免疫反应。
既然体内直接的原位 DC 细胞改造激活难度很大，那么，我们是否可以利用 mRNA-LNP 技术在体外更加安全和高效地激活 DC 细胞呢？
马萨诸塞州总医院(Massachusetts General Hospital)，简称 MGH，是哈佛医学院最原始和最大的临床教学、研究结构。位于 MGH 的 Garris 实验室多年来一直聚焦深入了解 DCs 细胞在癌症治疗中的发挥的关键作用。
2024 年 7 月 23 日，Garris Lab 与 Weissleder Lab 共同合作在 Small methods 发表文章：Lipid Nanoparticle-mRNA Engineered Dendritic Cell Based Adoptive Cell Therapy Enhances Cancer Immune Response，他们采用 mRNA-LNP 技术在体外改造激活 DC 细胞，再通过静脉注射将其回输体内，免疫小鼠，这种基于 mRNA 技术的过继性 DC 疗法表现出强烈的抗肿瘤 T 细胞反应，抑制肿瘤攻击，同时，未表现出任何毒性，提供了一种稳健可行的新型癌症治疗策略。
不同的脂质纳米颗粒递送 mRNA 至各种免疫细胞时表现出不同的效率。在这项研究，他们需要将 mRNA 递送至离体的骨髓来源的树突状细胞（BMDC）内，因此，选择了一种生物兼容性卓越、转染效率高的可电离脂质 cKK-E12 。
IL-12-eYFP 供体小鼠是一种用于免疫学研究的小鼠模型。这些小鼠通过基因编辑技术，将荧光蛋白 eYFP（增强型黄色荧光蛋白）与 IL-12 基因融合，使得 IL-12 的表达可以通过荧光标记进行追踪和研究。将 LNP-mRNAOVA转染源自 IL-12-eYFP 供体小鼠的 BMDC 细胞，随着 LNP-mRNAOVA剂量的增加，BMDC 细胞分泌的 IL12 也随之增加。更加重要的是，体外改造的 BMDC 细胞回输至小鼠体内存活时间超过 24h。
接下来，要搞清楚 LNP-mRNAOVA 转染 BMDC 细胞是否能够将抗原肽正常呈递给 T 细胞，并且刺激 T 细胞增殖？
SIINFEKL 是源自 OVA 的模型抗原肽，可以 MHC I 发生高亲和力结合。用剂量递增的 LNP-mRNAOVA转染 BMDC 细胞，BMDC 细胞细胞表面的 MHCI-SIINFEKL 复合物、MHC II 类、CCR7、CD40、共刺激配体 CD80 和 CD86 均出现出剂量依赖性的表达。并且，当 OT-I CD8+ T 细胞（特异性识别 MHC I-SIINFEKL 复合物）与 LNP-mRNAOVA转染的 BMDC 细胞共同孵育，结果发现 OT-I 细胞的大量增殖（以细胞膜染料稀释为表征）。这些结果表明在体外编码抗原的 mRNA-LNP 可刺激 DC 细胞成熟和 T 细胞增殖。
从 BL6 小鼠体内分离出骨髓细胞培养，在培养基中添加 FLT3L 和 GM-CSF 生长因子培养超过 9 天使其分化为 DC 细胞。在第 9 天时，用 LNP-mRNAOVA处理 BMDCs（1 µg mRNA OVA/million cells）。间隔 7 天，在 BL6 小鼠体内注射 3 次体外改造过的 BMDCs 或者未经改造的对照组 BMDCs。在注射第二次 BMDCs 后，向小鼠体内注射 B16-OVA 黑色素瘤肿瘤细胞。在首次注射 BMDCs 20天后，所有小鼠腹膜内注射抗 PD1 抗体。注射未经 LNP-mRNAOVA改造过的 BMDCs 对照组小鼠体内的肿瘤体积随时间明显变大，在第 17 天时，肿瘤体积超过 1500mm3，因而被处死。注射 LNP-mRNAOVA改造过的 BMDCs 的小鼠肿瘤体积极小，只有 50 mm3或者更小，因而存活时间明显更长。以上结果充分说明基于 mRNA-LNP 技术的体外工程化 DC 细胞过继性转移至受体小鼠后可保护小鼠免于肿瘤细胞的攻击。
NF-κB 诱导激酶（NIK）在非经典 NF-κB 信号通路中起关键作用。缺失 NIK 会影响 DC 细胞的发育和功能，进而减弱免疫治疗反应。NIKfl/fl 小鼠的 NIK 基因的关键外显子被两个 loxP 位点包围，利用 Cre-loxP 系统可在特定组织或细胞类型中选择性地敲除 NIK 基因。一旦使用 LNP-mRNACRE 转染源自 NIKfl/fl 小鼠的 BMDCs，会敲除掉 DC 细胞中的 NIK 基因。与正常的 LNP-mRNAOVA改造过的 BMDCs 辉输小鼠相比，将 LNP-mRNAOVA+ LNP-mRNACRE改造过的 BMDCs 回输至小鼠体内无法诱导 OVA 特异性 CD8 T 反应，体内肿瘤细胞体积的增长不会受到抑制。
小结
这项研究开发了一种基于 mRNA-LNP 技术的离体 DC 细胞工程改造策略，在体外激活 DCs 细胞，再将其回输至体内，刺激肿瘤特异性的 T 细胞反应，实现预防肿瘤生长的免疫保护效果。众所周知，LNP 无论注射部位如何，在肝脏中都有很高的积累。而且，肝脏也是一个免疫耐受部位，肝脏抗原呈递细胞不充分的免疫启动可能会抑制免疫反应。离体的 DC 细胞改造和随后的体内回输更加有利于诱导强大的肿瘤免疫反应，不会产生任何副作用。同时，研究者还发现除了让 DC 细胞表达特异性抗原，还可利用 mRNA 技术对 DCs 细胞进行功能化改造。
目前，国内获批临床的基于mRNA技术的DC肿瘤疫苗有3款。启辰生开发的是靶向Survivin DC细胞注射液，将编码抗原的mRNA-LNP转染DC细胞，再通过皮内或者静脉注射回输至患者体内，为原发性脑胶质母细胞瘤患者术后清除残余肿瘤细胞，防止复发，延长生存期。北京立康将编码数十个基于患自体肿瘤突变信息设计的个性化肿瘤抗原靶点的mRNA转染DC细胞，开发出国内首个获批临床的肿瘤新生抗原DC疫苗，用于治疗晚期实体瘤。同时期，四川康德赛也开发出一款获批临床的肿瘤新生抗原DC疫苗，用于治疗难治性/复发性卵巢癌。
