传统 LNP 包含 4 种成分:可电离脂质结合核酸分子，并协助其完成内体逃逸；两亲性磷脂促进细胞质膜和内体逃逸；胆固醇稳定 LNP 结构；PEG 脂质增强胶体稳定性并减少网状内皮细胞的清除。尽管传统的 LNP 安全有效，但是仅仅局限于肌内给药和针对肝细胞的静脉注射。传统 LNP 的局限性很大程度上源于其与极低密度脂蛋白的理化相似性以及吸附血浆中载脂蛋白 E 的倾向，导致其富集到肝脏中，并通过低密度脂蛋白受体被摄取到肝细胞中。传统 LNP 的这些特征虽说对肝脏类疾病的治疗是有益的，然而，严重阻碍了 LNP 在肝脏以外组织器官中的应用。
麻省理工学院 Langer 作为纳米递送领域化神级别的存在，多年以来，开枝散叶，门派蔚为可观，不少弟子已隐隐成为新一代宗主。Daniel Siegwart 也是一位从 Langer 和 Aderson 实验室走出来的悍将，他掌管的课题组位于美国德克萨斯大学西南医学中心 (UT Southwestern Medical Center)，长久以来一直专注于基因药物靶向性递送载体的开发，希望荡平递送障碍，发掘各种类型的 RNA（siRNA、miRNA、tRNA、mRNA）、质粒、基因编辑器等的体内治疗潜力，解决各种未被攻克的癌症、遗传性疾病、传染病等疾病。
随着基于 CRISPR 技术的基因编辑工具的爆发式迭代更新，人们寄希望于通过矫正基因组突变彻底攻克一系列人类遗传性疾病的困扰，例如镰状细胞病、血友病、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症、遗传性失明，当然还有癌症。但是，CRISPR 系统有一个主要缺点：该系统由大分子组成，很难进入细胞。要想将 CRISPR 技术真正应用于临床治疗，必须首先找到高效精准的递送载体。
2016 年，麻省理工学院 Anderson 实验室 Hao Yin 等人采用脂质纳米颗粒递送 Cas9 mRNA，同时利用腺相关病毒编码 sgRNA 和修复模板，借助此种递送策略来治疗人类遗传性酪氨酸血症小鼠模型，并表明该治疗通过纠正致病性 Fah 剪接突变产生了延胡索酰乙酰乙酸水解酶 (Fah) 阳性肝细胞，延缓小鼠体重减轻和肝损伤等疾病症状。然而，这种递送策略的缺点是肝脏细胞的编辑效率非常低，只有 6%左右。
2016 年 12 月，Siegwart 成为第一个成功采用两性离子脂质纳米颗粒（ZNP）共递送 cas9 mRNA/sgRNA 进行基因编辑的研究者。2020 年， Siegwart 开发出一种称为选择性器官靶向纳米颗粒递送系统 SORT，可精确地将治疗分子递送至肝脏或者肝外组织中。SORT LNP 系统是在原有的 LNP 传统 4 组分脂质成分中加入了第 5 种脂质成分，从而实现 mRNA-LNP 特异性的组织和细胞靶向性。如果添加的是永久性的阳离子脂质，那么递送后的 mRNA 蛋白表达主要出现在肺部；如果添加的是永久性的阴离子脂质，将会促进 mRNA-LNP 更多地富集到脾脏中；添加可电离脂质则会增加向肝脏中的递送。也就说，通过调整 SORT 分子（第 5 种脂质分子）的化学性质和数量能够改变 LNP 的递送靶向性。凭借 SORT 组织靶向性纳米颗粒递送系统，Siegwart 成为首个完成体内组织特异性基因编辑的学者。
近日，Siegwart 在 Science 发表重磅文章：In vivo editing of lung stem cells for durable gene correction in mice，他利用 SORT LNP 系统递送碱基编辑器，可在囊肿性纤维化小鼠体内实现肺干细胞（50%比例）持久的基因矫正效果。最初，Siegwart 想采用靶向肺部的 SORT 纳米颗粒(由 5A2-SC8、胆固醇、DOPE、DMG-PEG 及 DOTAP 组成)将基因编辑器递送至肺部组织驻留干细胞中，重构拥有矫正 CFTR 突变基因的肺表皮细胞。因此，首先要采用报告基因确认肺部靶向性的 SORT 纳米颗粒确实可以将基因编辑系统递送至肺部细胞，并且发生正常的基因编辑功能。
在正常情况，Ail4 Loxp-stop-Loxp tdTomato（tdTom）报告基因小鼠上游存在的终止元件（loxP-Stop-loxP, LSL）会阻断 tdTomato 基因表达。Cre 重组酶或者 CRISPR-Cas9 会移除终止元件，激活 tdTom 报告基因的表达，从而用来表征发生基因编辑的细胞。间隔 48h，分两次向 Ail4 小鼠静脉注射 Cre mRNA-SORT LNP(2 mg/kg)，整个肺部组织的荧光信号表达从注射后第 2 天一直持续到第 660 天。在多种类型的肺部细胞中均可检测到持续的荧光信号，例如，内皮细胞，表皮细胞，免疫细胞，NGFR+阳性干细胞或者 KRT5+阳性干细胞。内皮细胞和肺部驻留免疫细胞的存活时间为几天至几周，但是，在这些细胞中经过基因编辑引发的荧光信号确可以持续至 1.8 年，这说明肺部靶向性 Cre mRNA-SORT LNP 使得肺部驻留内皮祖细胞和免疫祖细胞发生了基因编辑，最终产生了一大群经过编辑的成熟细胞。
此外，肺靶向性 SORT LNP 表面的蛋白冠层富含玻连蛋白（vitronectin），因此表达玻连蛋白受体（VtnR）的细胞摄取 SORT LNP 的效率会增强。与其他器官相比（VtnR 阳性率小于 4%），肺部是 VtnR 阳性率最高（24.4%）的器官，这也是肺靶向性 SORT LNP 递送特异性的一个重要原因。
囊肿性纤维化(Cystic Fibrosis, CF)是一种罕见的常染色体隐形遗传性疾病，主要影响肺部和消化系统。CFTR 基因突变是导致囊性纤维化的根本原因。CFTR 是一种 cAMP 依赖性的氯离子通道蛋白，在许多器官的各种上皮细胞中表达，包括肺、胰腺、肝脏、消化道和生殖道，可驱动氯离子向细胞外分泌。由于基因突变导致 CFTR 功能丧失，氯离子无法转运至细胞外，引起通道黏液异常黏稠，造成通道堵塞，肺气道内的阻塞引发感染。
研究人员用 ABE mRNA-LNP 转染源自 CF 病人的原代人支气管表皮细胞（HBE），此细胞携带 R553X-F508del 杂合突变。转染完成后，未分化的 P2 细胞培养物(主要由基底细胞构成)和 P3 细胞培养物会均会发生大约 60%的等位基因矫正。测序鉴定发现 T7 位置矫正为 C 的概率为 83.7%，邻近 T11 位置矫正为 C 的概率为 14.5%，T17 位置矫正为 C 的概率为 0。即便 T11 位置矫正为 C，也不会带来恶性后果，因为 GGT 和 GGC 均编码甘氨酸。
在携带 R553X 突变 CFTR 突变等位基因和 CFTR 正常等位基因的小鼠中，静脉注射一针 ABE mRNA LNP，肺干细胞基因组 T7 位置显示矫正概率为 50%，肺组织和气管组织中基因组 T7 位置矫正概率分别为 12.2%和 28.7%。
小结
利用基因 CRISPR 技术对肺部肝细胞进行基因编辑以实现遗传性肺部疾病的长久治疗效果，大家对此越来越感兴趣。Siegwart 课题组巧妙地在传统 LNP 配方中加入第 5 种额外的脂质，通过改变脂质纳米颗粒的理化特性，SORT LNP 模块化递送系统可成功实现肝外器官的靶向性递送。同时，结合 CRISPR 技术，初步对肺部遗传性疾病的实现了长久治疗效果。Siegwart 为将 SORT LNP 平台技术更好地应用于基因治疗药物的开发中，创立了 ReCode 公司，旨在开发具有精准靶向性的基因治疗药物。就体内基因编辑药物的研发来说，国内也处于非常领先的地位，尧唐生物在今年 3 月份宣布其自主研发的国内首个采用脂质纳米颗粒(LNP)递送的体内基因编辑药物 YOLT-201 的临床试验已获 CDE 批准。相信在未来 CRISPR 技术与靶向性 LNP 技术的强强联合一定会加速体内基因编辑药物的研发，攻克更多罕见的遗传性疾病。
