作为一项革命性的技术，CRISPR 凭借精确的编辑效率和易于模式化的操作，在临床治疗领域蕴藏巨大的潜力。几年前，我也曾用 CRISPR 技术尝试在细菌里面做过一些敲除。从使用体验上来说，只要 gRNA 设计不出问题，操作起来很丝滑，成功率非常高。
简单聊几句 CRISPR 原理，相信大家大致了解 CRISPR 原理。首先，利用相关网站，设计 gRNA，选择评分高的 PAM 位点。gRNA 序列上有一段与基因组编辑位点区域形成碱基互补配对，因而，gRNA 可引导 Cas9 达到基因组特定切割位点，切割 DNA，引发双链断裂（DSB）。DNA 双链断裂后，细胞内存在两种修复途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）。通过导入 Donor DNA，可实现基因敲入。
Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 于 2012 年在《Science》杂志上发表了他们对 CRISPR/Cas9 系统的发现：A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity，并在仅仅八年后因其发现分享了 2020 年诺贝尔化学奖。自打 CRISPR 技术问世以后，许多课题组开始探索这种编辑工具的在基础研究和治疗领域的具体应用场景。
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输血依赖性β-地中海贫血（TDT）和镰刀状细胞病（SCD）是全世界最为常见的单基因疾病，均由血红蛋白β亚基因（HBB）突变引起的。引发 TDT 的 HBB 突变会造成β-珠蛋白合成减少 (β + ) 或缺失 (β 0 ) 以及 α 样球蛋白链和β 样球蛋白链（例如 β、γ 和 δ）之间的不平衡，从而导致红细胞生成无效。HBB 点突变将第 6 位亲水性谷氨酸替换为疏水性缬氨酸，由此产生镰状血红蛋白（HbS）。脱氧镰状血红蛋白聚合会导致红细胞变形、溶血、贫血、疼痛性血管闭塞发作，且发生不可逆终末器官损伤，预期寿命缩短。
突变导致镰状血红蛋白（HbS）聚合，形成镰状红细胞。
目前。科学家提出了 3 种基因编辑策略可用于治疗 SCD：
第一种，纠正突变β-珠蛋白基因。使用 CRISPR 诱导基因组发生 DSB，提供与野生型β-珠蛋白基因序列相同的 DNA Donor 进行同源重组修复。
第 2/3 种，利用 CRISPR 技术抑制γ-珠蛋白抑制因子的功能或引入模拟遗传性胎儿血红蛋白持续性表达（HPFH）的突变，诱导γ-珠蛋白亚基的表达。
由于镰状βs-珠蛋白的持续存在，γ-珠蛋白必须在血红蛋白形成中需要与镰状βs-珠蛋白形成竞争。虽然基因矫正提供了最简单的策略并可以防止 HbS（镰状血红蛋白） 的产生，但它可能会导致β-珠蛋白基因无法表达。此外，如果想使用 CRISPR 技术模拟 HPFH 突变，则需要进行非常精确的编辑。在这些策略中，唯一进入临床试验的基于 CRISPR 技术的 SCD 疗法是 CTX001。CTX001 由自体 CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）组成。在体外，使用 Cas9 和 gRNA 形成的核糖核蛋白（RNP）编辑 HSPCs，敲低红细胞特异性 BCL11A 增强子，诱导胎儿血红蛋白（HbF）表达。
胎儿血红蛋白 HbF（由两条 α 链和两条 γ 链组成）水平的升高与 TDT 和 SCD 患者发病率和死亡率的改善相关。血红蛋白的产生过程中存在一个非常有意思的发育变化过程，称为血红蛋白转换。HbF 通常从出生时占总血红蛋白的 85% 降至 1 岁时的 <1%，成人血红蛋白 (HbA) 随着年龄增长至 97%。残留的 HbF 在红细胞群体内分布不均匀，其表达仅限于 F 细胞。胎儿血红蛋白的表达受到发育调节，子宫内产生的 γ-珠蛋白水平在出生后随着 β-珠蛋白及成人血红蛋白（由两条 α 链和两条 β 链组成）的增加而降低。这样的话，患有 TDT 或 SCD 的新生儿和婴儿通常没有症状，并且，胎儿血红蛋白水平很高，然而，在出生第一年后，随着胎儿血红蛋白合成下降，相应的 SCD 症状开始显现。
2013 年，Daniel Bauer 和 Stuart Orkin 等人通过全基因组关联研究确定了与成人胎儿血红蛋白表达增加相关的单核苷酸多态性(SNP)。其中一些 SNP 位于 2 号染色体上的 BCL11A 位点，与 TDT 和 SCD 疾病严重程度的降低相关。BCL11A 是一种含锌指的转录因子。成年期红细胞中 BCL11A 表达的结果是增强β-珠蛋白（及 HbA）的生成，而 抑制γ-珠蛋白（及 HbF）的表达。与胎儿血红蛋白生成相关的 SNP 位于红细胞特异性增强子中，通过下调 BCL11A 表达，可增加胎儿血红蛋白的表达。
2019 年，Daniel Bauer 等人为了重现胎儿血红蛋白遗传持续性的表型，在造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 的 BCL11A 红细胞特异性增强子区域使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，确定了一组可用于减少 BCL11A 表达的 sgRNA 序列，恢复 γ-珠蛋白合成，重新激活胎儿血红蛋白的产生。这一发现是 Vertex 和 CRISPR Therapeutics 开发的疗法的基础，该疗法最初被称为 CTX001，现在被称为 exagamglogene autotemcel [exa-cel] 或 CASGEVY™。
来源：CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia
CTE001 介导的 BCL11A 敲低效应，来源：How CTX001 Therapy for Sickle Cell Disease Overcomes Many Challenges Associated with CRISPR Therapeutics
英国药品和保健品监管局 (MHRA) 于 2023 年 11 月 16 日批准 CASGEVY ™用于 SCD 和 TDT。这是世界上第一个被批准使用 的 CRISPR/ Cas9 基因编辑治疗药物。治疗药物的开发和批准是一个漫长且不确定的过程，从 2012 年发现 CRISPR/Cas9 基因编辑工具到 2023 年首次批准使用基于该工具的治疗方法疗法花费的 11 年。 CASGEVY™ 临床试验结果显示几乎所有患者都获得了非常积极的治疗效果。在 CASGEVY™ 的两项全球临床试验中，29 名镰状细胞病患者中的 28 名不再出现严重疼痛，42 名β地中海贫血患者中的 39 名至少一年不再需要输血。
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2.1
体外基因编辑的安全性
提取 HSPC ，通过细胞转染 RNP 进行体外基因组编辑。然后，将编辑成功的 HSPC 进行宿主移植，可增强对 CRISPR-Cas9 表达和脱靶效应的控制。HSPC 在植入宿主后的广泛自我更新带来的细胞扩增意味着仅需要移植少量编辑过的细胞。作为 Cas9 最常用来源的金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌经常感染人类，有研究者在 58-79%的健康人血液样本中发现了抗 Cas9 抗体，以及 Cas9 特异性的分泌干扰素-γ的 CD8+T 细胞。基于质粒或者 mRNA 的体内编辑方法存在 RNP 较为长期的持续性表达，而体外 CTX001 编辑疗法在转染细胞后，RNP 在递送后几乎立即切割染色体 DNA，并在细胞中迅速降解，从而消除有害的免疫反应风险，减少 Cas9 长期暴露相关的脱靶效应。
2.2
脱靶效应
CRISPR 产生的脱靶效应以及相关的不可预测或者有害的遗传变化是其临床应用的主要障碍。一般来说，CRISPR-Cas9 可以兼容多达五个 gRNA-DNA 之间的碱基错配，另一方面，也会触发非特异性切割，阻断基因功能，通过大片段插入、缺失或染色体重排造成基因组不稳定。在 CTX001 的临床前工作中，借助标记的双链寡核苷酸（dsOligo）标记的双键断裂，利用 GUIDE-seq 图谱鉴定出 52 个候选的脱靶位点。生信分析还鉴定出潜在的 171 个脱靶位点，其中 gRNA-DNA 之间错配数≤3 个或≤2 个。尽管如此，对 CTX001 编辑的健康 CD34+细胞的高覆盖测序在这些位点上没有发现脱靶编辑。这突出了 CTX001 编辑的特异性，可能是由于适当的 RNP 暴露时间和编辑程度，或编辑细胞群体中丢失了错误编辑细胞。在患者给药之前，对 CTX001 细胞进行候选脱靶位点的测序能够保证患者的治疗安全性。
2.3
BCL11A 突变和 HPFH
在患有遗传性胎儿血红蛋白持续性表达 (HPFH,hereditary persistence of fetal hemoglobin） 的镰状细胞患者中，HBG 启动子中自然发生的点突变可将血红蛋白合成从有缺陷的成人 β 珠蛋白转变为胎儿 γ 珠蛋白，并改善 SCD 临床严重程度。CTX001 疗法基于 BCL11A 增强子的天然遗传变异，同时，BCL11A 表达降低和 HbF 表达增强在人体内是耐受和常见的，这说明此位点的变异是一个安全有效的靶点。CTX001 破坏 GATA1 识别位点，导致 HbF 水平升高，旨在减少 BCL11A 表达来重现无症状 SCD 表型的 HPFH 现象。
转录因子在γ 珠蛋白基因启动子区域的结合位点（蓝色）与 HPFH 突变（红色）
2.4
谱系特异性的 BCL11A 敲低
增强子对于红细胞中 BCL11A 的表达是必须的，但是，在非红细胞中可有可无，例如，B-淋巴细胞，因此，选择性抑制 BCL11A 表达是完全可行的。谱系特异性的 BCL11A 敲低对于安全编辑分化中的造血干细胞是至关重要的，因为 BCL11A 对于出生后的发育和正常淋巴组织的生成是必需的。BCL11A 突变会造成胚胎缺乏 B 细胞，也会导致多种类型的 T 细胞发生改变。并非所有与 BLC11A 相关的治疗靶点都存在谱系特异性和高安全性。实际上，抑制 BCL11A 表达仅仅会影响珠蛋白基因，形成鲜明对比的是，抑制 BCL11A 的蛋白伴侣通常会导致红细胞成熟受损和广泛的基因效应。总的来说，CTX001 靶点的选择和体外编辑方法引发红细胞特异性的 BCL11A 敲低，无脱靶效应，具有极高的安全性。
2.5
编辑效率
CRISPR 编辑效率与成功编辑的细胞比例相关。不充分的编辑一直是 CRISPR 治疗过程中的主要阻碍之一，特别是在人原代细胞中。在 SCD 中，CTX001 会产生高效的全细胞等位基因编辑，充分提升 HbF 水平。在接受 CTX001 治疗的两个病人中，循环系统中表达 HbF(F 细胞)的红细胞比例可达到将近 100%。F 细胞中 HbF 浓度分布是 SCD 表型最为重要的决定性因素。在 5 岁以上的 HbS-HPFH 杂合子患者中，细胞 HbF 水平估计为 20-30%，并且均匀分布在红细胞中。在 HPFH 患者中的良性 SCD 和计算机模型表明 30% 的平均 HbF 水平可保护 70%的红细胞，与此一致的是，10-30% HbF 水平被认为可改善 SCD 死亡率。注射 CTX001 三个月后，细胞 HbF 水平便可超过 30%，一年后便可稳定在 42-48%左右。这些数据表明 CTX001 诱导产生的 HbF 水平远超所需标准，从而提供有效治疗。
2.6
NHEJ
CRISPR 诱导的 DSBs 修复也会影响基因编辑疗法的效果。NHEJ 是高等真核生物中的天然 DNA 修复途径，本质上是容易出错的，因为 DNA 末端切除引起的断裂处的小缺失会引发编码区的突变或者移位。CRISPR-Cas9 介导的遗传信息插入需要 HDR，这是一种使用同源供体序列作为模板的高保真修复机制。由于许多原因，人类细胞更喜欢 NHEJ 而不是 HDR，包括 NHEJ 完成速度更快，以及 NHEJ 抑制 HDR。此外，与 G2/S 期限制的 HDR 相比，NHEJ 在所有细胞周期阶段都具有更高效率和活性。HSPC 已被证明具有限的 HDR 能力，而且，由于其大部分处于静止状态和 DNA 修复机制组成，HSPC 会强制使用 NHEJ。因此，在破坏 BCL11A 增强子中，NHEJ 引发的突变非常适合 HSPC。使用不需要创造 DSB 的更加改进的 CRISPR 技术可缓解与 DNA 天然修复相关的疗效问题。
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CTX001 作为全球首款 CRISPR 药物成功获批绝对是基因治疗领域内的重要里程碑。在药物设计上，仅仅围绕编辑的精确性和特异性，将安全性置于首要地位。没有贸然对致病靶基因位点进行矫正，而是做了转录因子的敲低处理，更加重要的是，这种敲低效应具有谱系特异性。此外，合理设计 gRNA，严格控制 RNP 暴露时间，因而，没有发现任何脱靶效应，同时拥有极高的编辑成功率。结合 mRNA-LNP 技术的大力发展，希望不久的将来出现强靶向性和高安全性的体内编辑迭代药物，使得基因编辑药物迈入更高的台阶。
参考文献：
How CTX001 Therapy for Sickle Cell Disease Overcomes Many Challenges Associated with CRISPR Therapeutics.
CASGEVY™ – world’s first approval of a CRISPR/Cas9 gene-editing therapy.
