在 mRNA 体外合成中掺入修饰核苷酸是 mRNA 疫苗研发中的重要突破，不但解决了外源合成 mRNA 在人体内的免疫原性，还有助于增强 mRNA 稳定性。尽管修饰核苷酸已经广泛用于 mRNA 疫苗生产中，但是，对于修饰核苷酸是否影响蛋白质翻译过程依然缺乏了解。
12 月 6 号，Nature 杂志新上线了一篇重磅文章：N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting，研究人员首次发现N1-甲基假尿嘧啶核苷酸引发mRNA翻译过程发生核糖体移码，更加让人深感意外的是，BNT162b2 新冠疫苗免疫的小鼠和人体会存在对+1 移码突变抗原的脱靶 T 细胞免疫。这项研究让我们更加关注掺入修饰核苷酸对于 mRNA 疫苗抗原翻译保真度的影响，警惕错误翻译抗原潜在的脱靶免疫反应。尤其是，在序列设计时，借助同义密码子替换，消除潜在滑动序列，避免翻译过程发生核糖体移码。
很多病毒在复制过程中，会采用一种称为程序性核糖体移码（Programmed Ribosomal frameshifting ）的蛋白质合成重编码机制。在翻译蛋白的过程中，核糖体遇到 mRNA 序列上的移码信号或者稀有密码子时，发生停滞。其中大部分核糖体以原来的读码框翻译，但有一小部分核糖体在 RNA 上会向前（+1）或者向后滑动（-1）一个核苷酸，以新的读码框继续翻译。移码的结果就是病毒利用一条 RNA 为模板翻译产生两种蛋白，其 N-端序列相同，但 C-端序列不同。
病毒复制过程中发生的+1 或者-1 核糖体移码突变，图片来源：https://viralzone.expasy.org/860
研究人员设计合成了一种 Fluc+1FS mRNA，编码萤火虫荧光素酶的氨基末端 (NFluc) 和位于下游的互补羧基末端片段 (CFluc) 。Fluc+1FS mRNA 正常翻译会产生丧失催化活性的 NFluc，相反，如果发生+1 核糖体移码突变，则会翻译产生催化活性增强的 NFluc+CFluc。他们发现一个非常好玩的现象：未修饰的 Fluc+1FS mRNA 翻译合成的蛋白没有催化活性，而 N1-甲基假尿嘧啶修饰的 Fluc+1FS mRNA 翻译合成的蛋白（+1 核糖体移码突变）具有非常显著的催化活性。并且，使用其他修饰核苷酸合成的 Fluc+1FS mRNA 翻译合成的蛋白也没有催化活性。上述结果在体外翻译系统和 HeLa 细胞中均得以证实，同时，WB 胶也确认仅有 N1-甲基假尿嘧啶修饰的 Fluc+1FS mRNA 才会合成出分子量更大的条带。同时，与过往研究一致的是，N1-甲基假尿嘧啶修饰的 Fluc+1FS mRNA 会大量合成出正常阅读框（in frame）编码的截断蛋白 NFluc。相比之下，有一些修饰核苷酸的掺入严重抑制正常阅读框编码蛋白合成。
面对这种 N1-甲基假尿嘧啶修饰核苷酸带来蛋白翻译过程的核糖体移码，研究者想要知道 mRNA 疫苗翻译合成的+1 移码抗原框外肽（+1FS Spike）呈递给 T 细胞后，是否会引发脱靶细胞免疫反应。BNT162b2 免疫小鼠脾脏细胞对框外肽+1FS Spike 的刺激反应具有非常显著的 ELISpot 反应，形成明显对比的是，未免疫或者腺病毒载体疫苗免疫的小鼠均未检测到任何反应。同样，BNT162b2 免疫的人体 PBMC 细胞也会对框外肽+1FS Spike 的刺激产生明显 ELISpot 反应，而腺病毒载体疫苗免疫人体的 PBMC 细胞未出现 ELISpot 反应。当然，我们也可以看到，与腺病毒载体新冠疫苗相比，BNT162b2 免疫的小鼠和人体对于 Spike 抗原肽刺激具有更加强烈的细胞免疫反应。
研究人员用 LC–MS/MS 分析纯化的 Fluc+1F 移码蛋白，鉴定了 6 个框内肽（in-frame）和 9 个+1 框外肽。所有框内肽对应于 N 末端区域，而+1 移码肽对应于下游区域。也就是说，Fluc+1F 移码蛋白是由 N 端框内肽和+1 移码的 C 端框外肽组成的嵌合多肽。
错误翻译的蛋白可能是由于 DNA 突变、转录及翻译过程造成的。研究人员对未修饰和 N1-甲基假尿苷修饰的 Fluc+1FS mRNA 进行高通量测序，发现两者 mRNA 的缺失和插入图谱均非常相似，也就是说，N1-甲基假尿嘧啶触发引发+1 核糖体移码的原因不在于转录过程出现突变，而是翻译保真度受到影响。
研究人员发现，N1-甲基假尿嘧啶修饰的 mRNA 要比未修饰的翻译延伸速度缓慢，并且，会产生许多提前终止的短肽。巴龙霉素（PMN）结合的核糖体会可以掺入额外的近源或非同源氨酰基-tRNA，有效增加核糖体停滞位点的氨酰基-tRNA 数量。因此，在 N1-甲基假尿嘧啶修饰的 mRNA 翻译过程中，添加巴龙霉素会改善多肽链延伸。形成明显对比的是，添加巴龙霉素会抑制未修饰 mRNA 翻译过程，因为另一方面巴龙霉素会改变 18S rRNA 构象，抑制翻译。这些数据说明，N1-甲基假尿嘧啶修饰的 mRNA 在翻译过程中，核糖体发生停滞。
最后，研究人员鉴定了 3 种潜在的滑动序列（slippery sequences）。值得注意的是，与 Fluc+1FS 滑动位点 B 和 C 相同的 6 个滑动位点也分布在 BNT162b2 刺突 mRNA 编码序列中。所谓滑动序列是 mRNA 上可加快核糖体移动速度的一段序列，引发核糖体移码。研究人员通过同义密码子替换，破坏滑动序列，可有效减少核糖体移码发生，同时，保持翻译速率的一致。
小结
最后，聊聊这项研究是否会引发对于 mRNA 疫苗安全性的严重质疑？
在细胞中，任何 RNA 在翻译的过程中，都会由多个核糖体进行翻译，而不是一个。mRNA 与核糖体组装形成多聚核糖体（Polysome），就像是一条绳子上依次穿着很多珠子。有研究发现，N1-甲基假尿嘧啶的掺入，会导致 mRNA 翻译过程中的延伸速率降低，从而促进多聚核糖体组装。即便某个核糖体在翻译过程中出现移码，这并不意味着每个核糖体均会出现移码。也就是说，即便产生移码突变蛋白也只会在总蛋白中只会占据极小比例（从 WB 胶图中也可以看到）。
从核苷酸水平来说，辉瑞 BNT162 被和 Moderna mRNA-1273 在序列上完全不同，然而，两者的免疫反应和安全性是非常相似的。即便这两种疫苗在人体编码产生了罕见的移码抗原肽，它们在人体内也并未产生任何实质性的影响。更何况，关于 RNA 疫苗安全性的问题在各个层面已经得到大量科学研究的证实，目前依然没有发现任何证据表明 mRNA疫苗存在安全性问题，而且，过去三年，数十亿剂量在人群中大量的接种数据充分验证了 mRNA 疫苗的出色的安全性。
此外，这项研究并未采用 LC-MS 检测 N1-甲基假尿嘧啶核苷酸的纯度。因此有人怀疑这项研究中的核糖体移码是由于修饰核苷酸制备过程中的杂质造成的，而尿嘧啶制备中不易产生杂质。
