在上一期内容中，我们提到，Moderna 团队发现通过改变 mRNA 二级结构可增加 mRNA 功能半衰期，从而提升 mRNA 蛋白表达水平。可以看出，mRNA 半衰期与蛋白质表达水平之间存在密切关系。
最近，Alicia Bicknell 在第11界International mRNA Health Conference 会议上分享了设计高蛋白产出 mRNA 的一种策略：避免缓慢解码，减少翻译起始。她分析认为拥有高核糖体载量的编码序列展现出更高的翻译依赖的 mRNA 降解速率，在特定时间内，产生更少的蛋白。快速的翻译起始或者缓慢的翻译延伸导致高核糖体载量，最终导致 mRNA 半衰期变短。
我们本期内容，主要来看看如何理解 Alicia Bicknell 的观点。
2015 年，有学者发现密码子适应性（Codon Optimality）是芽殖酵母中 mRNA 稳定性的主要决定因素。首先，生物信息学分析表明最佳密码子的百分比与 mRNA 半衰期之间存在很强的相关性。例如，最佳密码子少于 40% 的 mRNA 的中位半衰期为 5.3 分钟，而最佳密码子超过 70% 的 mRNA 的中位半衰期为 20.1 分钟。如果将最佳密码子更改为非最佳密码子会使原本稳定的 mRNA 不稳定，而将非最佳密码子更改为最佳稳定的否则不稳定的 mRNA。值得注意的是，尽管密码子含量显然是 mRNA 稳定性的主要决定因素，但它并不能预测所有 mRNA 的半衰期。例如，几种组蛋白成分（例如 HHF2 和 HHT1）的 mRNA 含有 85% 的最佳密码子，但非常不稳定，半衰期分别为 2.4 分钟和 3.5 分钟。此类 mRNA 的半衰期可能由它们有效（或低效）启动翻译的能力或者 5'/3'UTR 元件决定。其次，他们发现核糖体在含有非最佳密码子的 mRNA 上要比含有最佳密码子的 mRNA 易位更缓慢，从而导致翻译延伸减慢。这项研究利用密码子适应性将 mRNA 衰变过程和翻译过程连接起来，最适密码子含量越高，mRNA 半衰期越长，翻译延伸越快，蛋白产出越高。
图片来自：Codon Optimality Is a Major Determinant of mRNA Stability
对于每个 mRNA 分子来说，有 3 个必须经历的过程：转录、翻译及降解。在细胞质中，mRNA 水平动态变化由转录速率和降解速率决定。有意思的是，细胞受到外界刺激时，RNA 水平的动态变化仅仅与降解速率（稳定性）相关。mRNA 稳定性会受到顺式作用元件和反式作用因子的双重影响。顺式作用元件主要包括密码子最适性、化学修饰、3'UTR 序列中富含 AU 的元件或者 miRNA 结合位点、GC 组成及 5'UTR 序列。在反式作用因子对 mRNA 稳定性的影响中，核糖体扮演着至关重要的作用，也就是 mRNA 翻译过程与其稳定性之间存在一定的关联。早在三十年前，人们发现 c-Myc mRNA PolyA 尾巴的缩短是依赖翻译过程的。至于，翻译到达会增强还是减弱 mRNA 稳定性存在着一定的争议。有研究借助全基因组研究发现，在酵母和哺乳动物细胞中，活跃翻译的 mRNA 同时也在发生降解。随着发现越来越多的与核糖体直接相互作用的降解因子，这种 mRNA 共翻译降解理论得到进一步支持。反面的例子当然也有，有些研究发现翻译可以保护 mRNA 不被降解，mRNA 翻译和降解是相互排斥的过程。
因此，mRNA 的翻译和衰变之间的关系并不是十分清楚，现有的结论也是相互矛盾的：翻译可以促进 mRNA 衰变或者稳定 mRNA。有研究人员发现在起始（eIF2α磷酸化）、延伸（放线菌酮和三尖杉酯碱）阶段抑制翻译或导致提前终止（嘌呤霉素）反应会导致 mRNA 变得更加稳定。虽然这些结果表明翻译促进了 mRNA 衰减，但无法排除这种现象是由整体性的翻译抑制通过改变其他途径引起的。
2023 年，瑞士巴塞尔 FMI 研究所 Jeffrey A. Chao 等人在 Molecular Cell 发表文章：Single-molecule imaging reveals translation-dependent destabilization of mRNAs。他们开发出一种控制特定转录本翻译的方法，将铁蛋白重链 mRNA 的 5' UTR（包含 IRE 铁响应元件）整合到 mRNA 中来实现。当细胞内铁离子浓度较低时，IRE 会招募铁调节蛋白 (IRP1/2)，通过阻止预起始复合物的招募来抑制翻译起始 。当胞内铁离子水平增加时，IRP1/2 蛋白与 IRE 分离，从而启动翻译。为了可视化活细胞中单个 mRNA 分子的翻译，将 SunTag 盒作为海肾荧光素酶 N 端融合蛋白整合进 CDS 区，并将 MS2 茎环整合到 3' UTR 中。SunTag 盒编码一系列抗原肽，可通过检测表达 GFP 融合同源单链抗体 (scFV-GFP)细胞中的新生多肽实现翻译可视化。24 个 MS2 茎环与 MS2 外壳蛋白 (MCP)-Halo 融合蛋白结合，可实现单个 mRNA 的可视化。为了限制可增加背景信号的成熟 SunTag 肽在细胞质中的积累，将不稳定的 FKBP 结构域融合到 SunTag-Renilla 编码序列的 C 末端。此外，研究人员将 IRE 整合到先前建立的 TREAT mRNA 的 5' UTR 中，由于存在耐受 Xrn1 降解的假结 (PK)，这样便可用单分子荧光原位杂交 (smFISH) 来区分完整的 mRNA 和稳定的 3' 降解中间体。
研究员利用上述系统研究翻译过程对 mRNA 稳定性的影响，发现一个非常有意思的现象：与未处理的细胞（翻译抑制）相比，经铁处理的细胞（翻译活跃）中完整 mRNA 比例减少得更快。这表明，与未发生翻译的 mRNA 相比，正在进行翻译的 mRNA 降解会更快。接着，研究人员在铁存在的情况下诱导 IRE-TREAT mRNA，但与铁再孵育 1 小时后，洗涤细胞并保存在含有铁螯合剂的 DMEM 中，与铁处理的细胞相比，铁螯合剂处理的细胞中完整 mRNA 比例有所增加，但低于从未用铁孵育的细胞中的比例。这说明，一旦终止翻译过程，mRNA 衰变便会减慢。此外，他们还发现这种依赖于翻译的 mRNA 衰变与密码子适应性无关。相比不存在铁的情况下，密码子去优化的 Renilla 转录本被发现在铁存在的情况下降解同样会更快。但是，与原始的 Renilla mRNA（密码子优化） 相比，密码子去优化的 Renilla 转录本降解更迅速，也就是半衰期会更短，这与前面提到的酵母中密码子适应性对 mRNA 半衰期的影响也相一致。
翻译依赖的 mRNA 衰变与密码子适应性无关，但是，密码子适应性会影响 mRNA 衰变速率。
为了搞清楚翻译依赖的 mRNA 不稳定性是由于正在延伸的核糖体数量（核糖体占有率，ribosome occupancy）造成的还是每单位时间启动翻译的核糖体数量（核糖体通量，ribosome flux）造成的，研究人员设计了两种具有不同长度开放阅读框（ORF）但具有相同的 5' UTR 和 3' UTR 的 mRNA（96nt 和 1884nt）。他们推断 ORF 的长度与延伸核糖体的数量相关，但由于 5' UTR 相同，核糖体通量应该保持不变。短 ORF 很可能一次只能容纳一个核糖体，而多个核糖体可以同时占据长 ORF。在铁存在的情况下，这两种 mRNA 都会以翻译依赖性方式降解。有趣的是，尽管 ORF 的长度相差约 20 倍，但两种 mRNA 的降解速度相似。这些结果表明，翻译依赖性的 RNA 衰减并不依赖于转录物上延伸核糖体的数量，而是取决于核糖体通量。
核糖体通量而不是核糖体占有率影响翻译依赖的 mRNA 衰变
研究人员还提出了一种渐进衰减数学模型，认为随着每轮翻译的推进，mRNA 降解率逐渐增加，也就是说，mRNA 降解概率随着每一轮翻译而增加。近端帽茎环已被证明可以降低翻译起始率，研究人员将具有 (SL) 和不具有 (ΔSL) 茎环的 5' UTR 整合到 SunTag mRNA 中，与 ΔSL-SunTag mRNA 相比，SL-SunTag 转录本上的核糖体平均数量减少，SL-TREAT mRNA 的降解速度比 ΔSL-TREAT mRNA 慢。
有趣的是，mRNA 预期寿命和翻译起始频率之间的关系是非线性的，并且在更快速的翻译起始频率下，mRNA 半衰期会达到一个平台，而不是持续下降，这表明核糖体通量对mRNA 稳定性的影响存在上限。
降低翻译起始频率（核糖体通量），会使得 mRNA 变得更加稳定。
小结
一方面，与非翻译状态相比，处于翻译活跃状态的 mRNA 存在衰变过程，称为翻译依赖的 mRNA 衰变（translation-dependent mRNA decay）。不管 mRNA 密码子适应性程度如何，只要发生翻译，均会触发 mRNA 衰变。翻译依赖的 mRNA 衰变速率与 ORF 长度无关，由核糖体通量（受5'UTR序列影响）来决定。降低翻译起始频率，会增加 mRNA 稳定性。既然翻译会促进 mRNA 降解，那么重新审视为什么高度翻译的高丰度转录本（例如，管家基因）也是一些最稳定的转录本是很有意义的，这表明存在某些机制（例如，某些反式作用因子）能够抵消掉翻译过程带来的降解效应。另外一方面，密码子适应性又会影响翻译中的 mRNA 稳定性。mRNA 上拥有的最适密码子含量越多，半衰期越长，核糖体易位更快速，翻译延伸更快，蛋白产出会更高。从上述两个方面来看翻译对 mRNA 稳定的影响，便能理解 Alicia Bicknell 提出的 mRNA 设计优化策略：降低翻译起始频率，避免缓慢解码。总的来说，翻译对 mRNA 稳定性的影响是非常复杂的，具有多种效应的叠加。
