嵌合两个Ⅰ型内含子的CPIE环化系统合成低免疫原性circRNA
文摘
2024-10-07 11:43
浙江
朋友们，假期只剩最后一天，看到一种新颖的环化系统，跟大家分享一下，刺激一下闲暇太久的大脑。1992 年，M.Puttaraju 首次重排具有自我剪接活性的 I 型内含子和外显子，将两个外显子（E1/E2）端对端融合，而内含子序列分裂为 3' Half/5' Half，在 GTP 和Mg2+作为辅因子的条件下，发生两次连续的转酯反应，E1/E2 环化连接为 circRNA。上述环化方法，称为基于Ⅰ型内含子的 PIE 环化策略，也是常用的体外合成短 circRNA 的方法。如果直接将 CVB3-IRES 和 EGFP 编码序列依次插入 T4 nPIE （基于 T4 噬菌体 Td 合酶内含子）和 Ana nPIE 系统（基于 Anabaena pre-tRNALeu 基因内含子），由于编码序列太长，无法观察到 precursor RNA 明显的环化。2018 年，Daniel G. Aderson 添加同源臂来提升 PIE 策略的环化效率，成功环化长 precusor RNA，并且采用 circRNA 在真核细胞表达外源蛋白。该方法目前仍然是 circRNA 疫苗/药物行业最为主流的环化策略。近日，山西高等创新研究院刘志达研究员、新加坡国立大学杨璐龄医学院/工程学院终生讲习教授陈小元、清华大学化学系喻国灿教授及淄博市中心医院王连庆副研究员等人在 Theranostics 发表文章：Developing an enhanced chimeric permuted intron-exon system for circular RNA therapeutics，将 T4 噬菌体 Td 合酶和Anabaena pre-tRNALeu 基因的两套天然内含子序列嵌合排列，成功设计出一种环化效率更高的 CPIE 系统。在此系统中，线性 precursor RNA 通过两种途径产生 circRNA。一方面，PIEⅠ 模块借助同源臂互作可快速协助 PIEⅡ折叠，通过内部的PIEⅡ模块直接产生 circRNA，即在 E3/E4 剪接位点发生环化反应。另一方面，percursor RNA 通过外部的PIEⅠ模块首先会产生一个 circRNA 中间体(E1/E2 位点发生剪接)，再借助内部的PIE Ⅱ模块产生最终的 circRNA。
基于 CPIE 系统，研究者设计了两种不同的 CPIE 系统：CPIEa（ Anabaena pre-tRNALeu基因的内含子位于外面，T4 噬菌体 Td 合酶基因内含子位于里面）和 CPIEb（T4 噬菌体 Td 合酶基因内含子位于外面，Anabaena pre-tRNA^Leu^ 基因的内含子位于里面）。将 CVB3-IRES 和 EGFP 编码序列依次插入 CPIEa 和 CPIEb，经过体外转录和环化反应，终产物的凝胶电泳明显检测到 circRNA 生成。在 CPIEa 和 CPIEb 系统内引入了PIEⅠ模块的剪接位点突变，分别产生了 mCPIEa 和 mCPIEb。采用 RT-qPCR 评估从 IVT 和剪接反应获得的 RNA 产物中的 RNA 环化效率，与 T4-nPIE 和 Ana-nPIE 相比，mCPIEa 和 mCPIEb 表现出更高的环化效率，这说明即便PIEⅠ在非活性状态下对于 RNA 环化也具有重要作用。与 mCPIEa 和 mCPIEb 系统相比，CPIEa 和 CPIEb 系统都表现出更加优异的环化效率，这说明处于催化活性状态下的 PIEⅠ模块会增强 PIE Ⅱ 模块介导的 RNA 环化反应。
关于外源合成 circRNA 免疫原性来源有两种说法，第一种认为基于 T4 噬菌体 Td 合酶或者Anabaena pre-tRNALeu基因Ⅰ型内含子的 PIE 策略合成的 circRNA 序列中会残留 74nt 或者 186nt 的 E1+E2+间隔序列，影响 circRNA 折叠构象，被细胞内 RNA sensor 识别，触发强烈的天然免疫反应。第二种观点认为，体外合成的 circRNA 并不会引起免疫反应，之所以存在免疫反应时因为 circRNA 产物中存在少量的线性 RNA 杂质。高度纯化的 circRNA 样品可成功消除天然免疫反应。采用 CPIEa 和 CPIEb 系统制备的 circRNA 中残留疤痕序列分别仅为 38bp 和 17bp，明显低于先前的 ePIE 系统（基于Anabaena pre-tRNALeu 基因内含子的 PIE 系统）。在经过 HPLC 纯化后，用 ePIE 和 CPIE 产生的 circRNAEGFP分别转染 A549 细胞，检测触发的天然免疫反应。结果表明，与未修饰的线性 mRNA 相比，circRNA 表现出较低的免疫原性，而且通过 CPIE 制备的 circRNA 免疫原性明显低于通过 ePIE 制备的 circRNA 免疫原性。
CPIE 系统制备的 circRNA 细胞水平的翻译效率在经过 HPLC 纯化后，用 CPIEa 和 CPIEb 合成的circRNAEGFP转染细胞与甲基假尿嘧啶修饰的线性 EGFP mRNA 表现出相当的荧光蛋白翻译水平，但是，circRNAEGFP要比线性 EGFP mRNA 展现出更加长久的蛋白表达时间。具体来说，在 HEK293F 细胞中，circRNAEGFP 的蛋白质表达半衰期约为 118 小时，而修饰的线性 mRNA 约为 60 小时。在 HEK293T 细胞中，circRNAEGFP的蛋白质表达半衰期约为 90 小时，而修饰的线性 mRNA 的蛋白质表达半衰期约为 55 小时。
CPIE 系统制备的 circRNA 应用于预防性/治疗性肿瘤疫苗。采用 CPIEb 制备 circRNAE7-D2GFP，表达源自 HPV 的 E7 抗原（43-62aa）和不稳定的绿色荧光蛋白（D2GFP）。用 LNP 包封的 circRNAE7-D2GFP免疫小鼠（剂量为 10μg，间隔两周），在 TC-1 攻击后，与对照组相比，circRNA circRNAE7-D2GFP免疫组均无肿瘤生长。使用 circRNAE7-D2GFP-LNP 疫苗作为治疗性疫苗时，可有效触发 E7 特异性 T 细胞反应，抑制肿瘤生长，延长 TC-1 荷瘤小鼠生存时间。
基于自我剪接活性的Ⅰ型内含子 PIE 策略仍然是 circRNA 体外合成的首先方法，由于它的反应条件相对温和简单，并且相对来说更易于纯化。但是，circRNA 大规模生产和下游纯化一直面临诸多挑战。在 PIE 策略中，Daniel G. Aderson 添加外部同源臂和内部同源臂促进环化反应。在 CPIE 系统中，利用中等长度的同源臂（20bp）将两个独立的剪接泡固定和分离。虽然看起来，CPIE 要比 PIE 系统更加复杂—利用外部的 PIE 取代了先前系统中的外部同源臂，但是，外部 PIE 提升了环状中间体的形成，促进内部 PIE 在分子内引发反应，增强整体的环化效率。还有一点引人关注的是，利用 CPIE 系统产生的 circRNA 序列中的疤痕序列（CPIEa，38 bp;CPIEb，17 bp）要明显低于先前的 ePIE 系统（基于 Anabaena pre-tRNALeu基因的内含子的 PIE 系统），从而有效降低 circRNA 免疫原性。这种嵌合两个不同 I 型内含子的 CPIE 系统高效的环化效率确实让人眼前一亮。作为体外 circRNA 制备的创新工程平台，CPIE 系统成功应用于针对肿瘤和传染病的 circRNA 疫苗的生产，表明其在推进 circRNA 临床转化应用方面拥有巨大潜力。
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