常见给药途径主要有肌肉注射（IM）、皮下注射（SC）、静脉注射（IV）、皮内注射（ID）、腹膜注射（IP）及鼻腔（IN）或者气管滴注（IT）。目前 LNP 是最为主流的 RNA 递送载体，当然，也不断涌现一些新型递送载体，例如，专门用于递送 saRNA 的高分子量阳离子聚合物 pABOL。大家肯定很想知道不同给药途径下，不同递送载体包封的 RNA 在体内不同器官组织的分布、蛋白表达动力学特征及触发的免疫反应，本期内容，我们一探究竟。
递送载体与给药途径影响线性 mRNA 体内分布和表达
大概在十年前，人们还未普遍采用 LNP 作为外源 mRNA 的递送载体。2015 年，专注于开发脂质纳米颗粒递送系统的加拿大 Acuitas 公司（Pieter Cullis 为创始人之一）与 Drew Weissman 课题组合作（Norbert Pardi 为一作）采用 LNP 递送编荧光素酶的 mRNAFLuc，选择 6 种不同的给药途径，对 mRNAFLuc-LNP 注射后在体内的分布和荧光素酶蛋白表达动力学展开研究，这项工作获得的数据充分说明 LNP 非常适合外源合成 mRNA 的体内递送。
递送载体影响线性 mRNA 细胞水平蛋白表达
裸 mRNA 几乎无法转染永生细胞系和原代细胞，但是，当阳离子聚合物或者脂质转染试剂包封 mRNA 后，转染效率可达到 60%-90%。LNP 表面在生理 PH 下呈电中性，虽然在体内递送效率非常高，但是，由于缺乏表面正电荷，很难在体外被细胞摄取。将 mRNA-LNP 与 ApoE 载脂蛋白孵育后，再去转染 DC 细胞会极大提升mRNAFLuc摄取效率和表达水平。HEK293T 细胞表面本身就有 ApoE 受体，也分泌 ApoE 载脂蛋白，所以额外添加 ApoE 载脂蛋白并不会提升 mRNAFLuc-LNP 转染效率。
与转染试剂 Lipofectin 或者 TransIT 转染试剂相比，mRNAFLuc-LNP 均在转染细胞后 24h 荧光素酶表达会达到最高峰。
不同给药途径下的线性 mRNA 体内分布
小鼠静脉或者腹膜注射 mRNAFLuc-LNP（5ug ）。在注射 24h 后，脂质纳米颗粒富集于肝脏，在肝脏中检测到强烈的荧光信号，然而，随着时间增加，肝脏的荧光信号快速减弱。到第 3 天，小鼠肝脏中已检测不到荧光信号，只有注射部位的小部分荧光信号持续表达。
与静脉或者腹膜注射类似，小鼠肌肉注射或者气管滴注 mRNAFLuc-LNP，大部分荧光信号也会立马出现在肝脏，表明脂质纳米颗粒从注射部位扩散至全身。并且，肝脏中的荧光信号同样快速减弱，注射 2 天后荧光信号消失。有意思的是，肌肉注射或者气管滴注后（注射 4h），在肌肉组织和肺部观察到强烈的荧光信号，肌肉中的荧光信号还会持续表达至直射后第 8 天。
皮内或者皮下注射 mRNAFLuc-LNP 仅在注射部位观察到荧光信号，持续时间为注射后 6-10 天。
不同给药途径下的线性 mRNA 表达动力学
总体来看，6 种给药途径下注射的mRNAFLuc-LNP 在小鼠体内表达的荧光素酶峰值集中出现在注射后 4h 左右，峰值过后，随着时间的延长，均出现不同程度的衰减。静脉注射或者气管滴注的 mRNAFLuc-LNP 在体内表达持续时间最短；皮下或者腹膜注射的 mRNAFLuc-LNP 在体内表达持续时间较短；肌肉或者皮下注射 mRNAFLuc-LNP 体内荧光素酶表达持续时间最长（注射后第 10 天）。相比其他给药途径，小鼠体内荧光素酶表达总量与静脉注射或者气管滴注 mRNAFLuc-LNP 剂量呈现极为明显的剂量依赖效应。
递送载体与给药途径影响 saRNA 体内分布和表达
伦敦帝国理工学院 Robin J. Shattock 教授在自复制 RNA 疫苗的机制研究和工艺开发方面做出了卓越的成绩。2020 年，Robin 实验室的博后 Anna Blakney (现在不列颠哥伦比亚大学大学 UBC 拥有独立实验室) 设计了一种线性的阳离子聚合物 pABOL 用于体内递送 saRNA ，并表明增加其分子量可以增强递送效率。同时证明，与市面上销售的其他聚合物相比，采用肌内和皮内注射 pABOL-saRNA 均可增强蛋白表达和细胞摄取，并且小鼠肌内注射 pABOL-saRNA 流感疫苗可提供完全的免疫保护。
2021 年，Anna Blakney 头对头比较了 pABOL 和 LNP 作为 saRNA 递送系统在蛋白表达和疫苗免疫原性方面的差异，证实 saRNA-pABOL 制剂在体内触发更高水平的蛋白质表达，更适合蛋白替代疗法，而 saRNA-LNP 制剂会使得 saRNA 更具免疫原性，更适合用于疫苗开发。
近日，Anna Blakney 又在 Journal of Controlled Release发表文章：Delivery vehicle and route of administration influences self-amplifying RNA biodistribution, expression kinetics, and reactogenicity，对不同给药途径下的 saRNA-LNP 制剂与 saRNA-pABOL 制剂在体内的分布、表达动力学特征及反应原性展开头对头比较，结果发现：腹膜内途径可实现更广泛的生物分布和更高的 saRNA 表达；LNPs 在 RNA 递送效率方面表现出色，但会诱发严重的炎症；较高的 RNA 转染并不总是与较高的蛋白表达相关；反应原性受生物分布调节。
不同给药途径和递送载体的 saRNA 体内分布
saRNAFLuc-pABOL 和 saRNAFLuc-LNP 两者的粒径、PDI 及电镜下的结构特征类似，唯一的区别在于，LNP 制剂表面接近中性（-3.1mV），而 pABOL 制剂表面带正电荷（+22.2mV）。
选择 6 种不同的给药途径，分别为肌肉注射、皮下注射，皮内注射、静脉注射、腹膜注射及鼻内滴注，向 8 周龄雌性 BALB / c 小鼠体内注射 5ug saRNAFLuc-LNP 制剂或者-pABOL 制剂。注射 2 天后，活体成像检测小鼠体内荧光素酶表达情况。
注射 saRNAFLu-LNP 制剂的小鼠，除静脉注射组和鼻内滴注组外，其他 5 种给药途径的小鼠体内均检测到明显的荧光信号。相反，注射 saRNAFLuc-pABOL 制剂的小鼠，仅仅在肌肉注射组体内检测到强烈的荧光信号。
对注射 saRNA 制剂 48h 后的小鼠组织进行离体成像和荧光定量 PCR 检测：
肌肉注射 saRNAFLuc-LNP或者-pABOL 制剂的小鼠肌肉组织中观察到非常明显的荧光信号，并且 pABOL 制剂组的发光量是 LNP 组的 2 倍。
腹膜注射 saRNAFLuc-LNP：小鼠肺部、脾脏及肾脏中检测到极低的荧光信号，其体内的荧光信号分布呈现更加的广泛性，说明腹膜注射射 saRNAFLuc-LNP可扩散至全身。
鼻内滴注saRNAFLuc-LNP 的小鼠肺部能检测到明显的荧光信号。
肌肉注射 saRNAFLuc-LNP 的小鼠肺部和脾脏中的荧光信号较低。
腹膜、静脉及皮下注射 saRNAFLuc-LNP 的小鼠脾脏中可检测到 saRNA 转录本存在，而且，腹膜中 saRNA 转录本是对照组的 7 倍多。只有鼻腔滴注 saRNAFLuc-LNP 的小鼠肺部才会检测到 saRNA 转录本存在。
在肌肉注射 saRNAFLuc-LNP 小鼠肌肉组织中，Fluc/saRNA 转录本含量均比 pABOL 制剂组明显高出很多。
不同给药途径和递送载体的 saRNA 体内表达动力学
肌肉注射 saRNAFLuc-LNP，在注射后第一周内产生相当稳定的荧光素酶表达，到第 8 天，荧光素酶表达水平达到峰值，随后开始逐渐缓慢下降，一直持续至第 29 天。
皮下注射 saRNAFLuc-LNP 表现出极其独特的表达特征，在注射后第 2 天，荧光素酶表达水平达到峰值，随后一直持续下降至第 6 天至最低水平，随后荧光素酶表达水平又开始重新增加，至第 14 天重新达到峰值，往后又持续衰减至第 29 天。
腹膜内注射saRNAFLuc-LNP，荧光素酶表达水平在第 2 天达到峰值，并且是所有给药途径中的最高值。随后，与其他途径类似，荧光素酶表达水平开始持续下降，至第 4 天达到最低点，在最终持续衰减之前的两周时间里荧光素酶表达水平基本维持恒定。
遗憾的是，鼻内滴注 saRNAFLuc-LNP 的荧光素酶表达水平极低，持续时间最短。
与 LNP 制剂完全不同，肌肉注射saRNAFLuc-pABOL 制剂，小鼠体内荧光素酶表达水平从注射第 2 天开始增加，一直持续到第 10 天，随后发生持续的、明显的衰减。到第 23 天，完全丧失荧光素酶表达水平。相反，皮下注射 saRNAFLuc-pABOL 制剂，小鼠体内荧光素酶表达水平恒定在极低水平，持续至第 25 天。除此之外的其他 saRNAFLuc-pABOL 制剂给药途径，小鼠体内荧光素酶完全不表达。
通过小鼠体内累积荧光通量评估 saRNA 总蛋白表达量。对于 saRNAFLuc-LNP 制剂来说，腹膜注射 saRNAFLuc-LNP 体内蛋白表达总量最高，鼻内滴注 saRNAFLuc-LNP 体内蛋白表达总量最低。与 LNP 制剂的蛋白表达形成鲜明对比的是，肌肉注射 saRNAFLuc-pABOL 制剂体内蛋白表达总量异常的高。
不同给药途径和递送载体的 saRNA 体内反应原性
研究检测不同给药途径注射小鼠血清中的细胞因子，结果显示：腹膜或者肌肉注射（全身递送）saRNAFLuc-LNP 制剂会引起非常明显的炎症反应，然而，给药 48h 后，促炎细胞因子基本恢复到基线水平，KC、GM-CSF、TNF-α 和 IP-10 除外。相反，pABOL 制剂触发的炎症反应相对较弱。
此外，研究人员还检测了肌肉或者腹膜注射小鼠不同气管中的干扰素刺激基因的表达，结果显示，只有肌肉注射 saRNAFLuc-LNP 制剂会在肌肉组织中明显增强干扰素刺激基因的表达。
小结
根据不同的治疗目的来选择递送途径和载体系统，例如，LNP 制剂触发明显的炎症反应，更适合开发 mRNA 疫苗，而 pABOL 制剂蛋白表达量高且炎症反应非常弱，更加适合开发基于 mRNA 技术的蛋白替代疗法；腹膜注射可实现体内更广泛的 mRNA 分布，而鼻腔或者气管滴注仅在肺部检测到 mRNA 分布，并且蛋白达总量最少，持续时间最短。不同给药途径下，线性 mRNA-LNP 在注射后 4h 体内蛋白表达到达峰值，随后在 7-10 天之间出现不同程度的明显衰减，相反，saRNA-LNP 在注射后 2 天体内蛋白表达达到峰值，随后发生衰减，并且维持恒定的较低的表达水平至 29 天。总的来看，递送系统、给药途径、RNA 类型与体内分布、蛋白表达、反应原性存在复杂的相互作用，深刻影响 RNA 疫苗的免疫原性或者治疗效果。
