如何将全须全尾的 mRNA 分子（5'Cap+CDS+3'PolyA）从体外转录反应混合液中给钓出来是 mRNA 原液（Drug Substance）生产中最为关键的问题之一。特异性的oligo dT亲和层析（Affinity Chromatography）是当前最为主流的 mRNA 纯化工艺，此外，还存在许多其他可搭配使用的层析手段，例如，疏水层析，阴离子层析，复合层析等。在高离子强度流动相中，mRNA 链间因骨架携带负电而导致的链间紧绷排斥得到中和放松，彼此之间得以靠近。所以，mRNA-PolyA 便可在高离子强度流动相中接近固定于亲和层析填料上的寡脱氧胸苷酸 (oligo dT) 配基，通过 A-T 之间的氢键结合到亲和层析填料的配基伤，那些 IVT 反应混合液中所有不携带 PolyA 的分子全部（酶、游离核苷酸、盐、短链或者没完成加尾的 mRNA 分子）流穿而出。在低离子强度流动相中，由于带负电荷的磷酸骨架之间相互排斥，mRNA 链上的 PolyA 尾巴与亲和填料上的 oligo dT 配基之间的相互作用发生破坏，从而将 mRNA-PolyA 从亲和填料上洗脱下来。
目前，市面上销售的可规模化生产的 oligo dT 亲和层析填料主要以 POROS™oligo(dT)25 和 CIMmultus ®oligodT18 整体柱为代表。POROS™oligo(dT)25 树脂由 50 µm 多孔聚（苯乙烯-二乙烯基苯）基质构成，借助 Linker，可偶联上与 25 个碱基组成的寡脱氧胸苷酸(oligo dT-25) 。POROS™oligo(dT)25 树脂是一种刚性结构，孔径大小为 0.2μm，适合纯化较大的生物分子。较大的孔径可提升树脂可结合的表面积，减少大分子穿越基质时的传质限制。据称，采用 POROS™oligo(dT)25 填料可实现的动态结合载量（DBC）高达 5mg/mL。mRNA 的长度和层析流速会对 POROS™ DBC 会产生显著影响，例如，对于较长的 mRNA 来说，POROS™ DBC 会发生明显下降。
CIMmultus® 整体柱由聚甲基丙烯酸酯组成，其特征是高度互连的通道，溶质在整体柱中的流动是连续的，其传质方式只依靠对流传质。整体柱最吸引人的地方在用于流速可以开到很高，节省时间，因为高流速对于整体柱 DBC 的影响非常微弱。据报道，根据所选缓冲液组分的不同，整体柱纯化 mRNA 的 DBC 范围可从 2–4 mg/mL 到高达 6 mg/mL。
据称，目前 IVT 反应产量大致在 5-10mg/mL，而目前偶联有 oligo dT 多孔树脂填料和整体柱的载量仅在 2-6mg/mL。为更进一步提升 oligo dT 的结合载量，Cytiva 公司研究团队在 Journal of Chromatography A 发表文章：Improved mRNA affinity chromatography binding capacity and throughput using an oligo-dT immobilized electrospun polymer nanofiber adsorbent，他们开发了一种新型填料 oligo dT Fibro™由静电纺纤维素纳米纤维构成，上面偶联有 oligo dT(12-30 个碱基)。oligo dT Fibro™ 基质具有开孔结构(0.2-0.3μm)和大表面积，可实现大分子的有效传质，并在极短的保留时间内实现高 DBC。
比较三款填料的动态结合载量（DBC）
通过三款填料的保留时间（流速决定）与 DBC10%（流穿中 mRNA 浓度达到上样浓度的 10%时层析填料的 DBC）之间的关系可看出以下几点：
第一，在不同保留时间下，oligo dT Fibro™的 DBC10%远远超过 CIMmultus® 整体柱（3-4 倍）和 POROS™oligo(dT)25（9-13 倍）。
第二，Fibro™ 和 CIMmultus® 整体柱的保留时间小于 10 秒依然具有良好的 DBC，而 POROS™ 填料由于压力和流速限制，要想保证良好的 DBC，保留时间必须要大于 60 秒。
第三，随保留时间的减少，CIMmultus® 整体柱 DBC 的变化相对平缓，而 oligo dT Fibro™与 POROS™oligo(dT)25 DBC 减少非常显著。
mRNA 长度和序列对三款填料 DBC 的影响
在纯化不同长度和序列的 mRNA 时，Fibro™依然表现出最高的 DBC，比 CIMmultus® 整体柱高出 2.5-4 倍，比 POROS™oligo(dT)25 高出 2-4 倍。对于三款填料来说，DBC 均和 mRNA 长度呈现负相关，mRNA 越长，DBC 下降越明显。
流动相盐浓度对三款填料 DBC 的影响
增加流动相盐浓度，可增强 mRNA 与亲和层析填料配基之间的相互作用，但是，过高的盐浓度会导致 mRNA 沉淀析出。在不同的氯化钠盐浓度中，Fibro™依然表现出最高的 DBC。随着盐浓度的提升（200mM~800mM），Fibro™填料 DBC 明显增加。对于 1900nt mRNA 来说，DBC 提搞高 3~4 倍；对于 4300nt mRNA 来说，DBC 提高 2.5-5 倍。对于 1900nt mRNA 来说，三款填料的 DBC 对于盐浓度均呈现出依赖性，有意思的事，对于 4300nt mRNA 来说，CIMmultus® 整体柱和 POROS™oligo(dT)25 填料 DBC 随盐浓度增加未发生太大变化。
三款填料纯化 IVT 反应混合液的性能
使用三款亲和 oligo dT 填料对 1900nt mRNA2 和 4300nt mRNA3 的 IVT 混合合成液进行纯化，上样/平衡缓冲液氯化钠盐浓度为 600mM，流速为 120 cm/hr。采用 Monarch® RNA Cleanup Kit 试剂盒纯化 IVT 混合合成液计算上样初始 mRNA 量。从纯化后 mRNA 的回收率、T7 酶残留（＜0.2 pg/μg mRNA）、dsRNA 残留（mRNA2 和 mRNA3 分别为<2.5 ng /μg mRNA 和<1 ng /μg mRNA）及纯度来看，三款填料的纯化后的mRNA回收率和关键质量属性旗鼓相当。
小结
层析填料的 DBC 是纯化过程中检测样品负载量的关键参数。较高的 DBC，可减少层析填料体积，节省成本。当以 120 cm/hr 纯化 1g mRNA 时，Fibro™ 所需的基质体积比 CIMmultus® 整体柱少约 2.5-3 倍，比 POROS™ 层析树脂少约 2-4 倍。相应的，纯化时间也发生显著减少，与 CIMmultus® 整体材料相比几乎缩短了 2 倍，与 POROS™ 树脂相比更是惊人的 20-25 倍。Fibro™ 填料 DBC 和通量的提升并不以纯化后的 mRNA 回收率和质量属性为代价，因为三款填料纯化后的 mRNA 回收率和关键质量属性均是类似的。oligodT Fibro™既可以实现整体柱一样的高流速，又可保证较高的结合载量。此外，我们也可以看到 oligo dT 亲和填料 DBC 会受到流速、缓冲液盐浓度、mRNA 序列及长度的影响。
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