肌肉或者引流淋巴结中的天然免疫细胞摄取 mRNA-LNP 后，有三个过程会触发细胞内的天然免疫反应：第一，可电离脂质在胞内体酸性环境中质子化，破坏内体膜，触发第一个天然免疫信号；第二，从脂质纳米颗粒中释放至细胞质中的外源合成 mRNA 是第二个天然免疫信号，如果没有插入修饰核苷酸或者存在 dsRNA 杂质会强烈刺激天然免疫反应；第三，可电离脂质本身具备的免疫原性，需要通过可电离脂质的快速降解来消除。综上所述，除了 mRNA 自的免疫原性，可电离脂质也有免疫刺激活性，会引发炎症反应。
对于 mRNA 疫苗来说，mRNA-LNP 具备的天然佐剂特异性是有利的，但是，过度的炎症反应会抑制抗原表达，并且还是一系列接种副作用的根源，例如，疼痛、肿胀、发烧和罕见的心肌炎。试想一下，人们要是接种 mRNA 疫苗后的副反应很强烈，就算免疫保护效果再好，心理肯定会产生畏惧。因此，需要想办法对 mRNA 疫苗做出优化，使得机体更加耐受。
设计用于快速生物降解的可电离脂质是一种非常有前景但未被充分探索的炎症抑制策略。Omar F. Khan 教授是加拿大核酸治疗学研究主席，同时，也是 Tiba Biotech（位于波士顿的 RNA 疫苗公司）的科学创始人和首席科学家，其实验室位于伦多大学生物医学工程研究所。近日，Khan 课题组在 bioRxiv 公开上传了一项研究，他们设计了一系列用于小鼠肌肉注射、可生物降解的可电离脂质。通过调整 LNP 表观 pKa 可以最大化 mRNA 的蛋白质表达。更加易于水解的 LNP ，可以从组织中更加快速地代谢清除，触发更低的炎症反应，同时保持强大的免疫原性。这些发现表明，快速降解的可电离脂质可以平衡 mRNA 疫苗的功效和耐受性，对解决 mRNA 接种副作用具有重要意义。
可调节 pKa 的生物降解可电离脂质
Khan 课题组前期开发了一种用于肌肉注射的新型可电离脂质，称为βN2，由三个部分组成：胺核，酰胺 Linker 和碳氢化合物尾部。碳氢化合物尾部控制脂质与 mRNA 的自组装，Linker 中的碳数量调整脂质 pKa，乙醇胺核心提高递送效率。βN2 的 Linker 中存在以其化学稳定性而闻名的酰胺，试想用酯类替换βN2 的酰胺，可能会带来更加快速的生物降解和体内清除。
表观 pKa 大致表示 LNP 获得正表面电荷的 pH 值，必须在 6 到 7 之间精确调节。如果表观 pKa 超出此范围，则 LNP 通常具有毒性或输送效率低下。为了精确调节表观 pKa，研究人员合成了一系列βN2 的酯类似物，每种可电离脂质都含有与βO2 相同的胺核和烃尾部，但酯基和叔胺之间 Linker 长度系统地增加以调节 pKa。
调整 LNP 表观 pKa 最大限度地提高肌内 mRNA 递送效率
βO2 形成了与βN2 相似粒径和电荷的 LNPs，具有相同的粒径（110 nm），低多分散指数（PDI < 0.1），以及较小的负平均 zeta 电位（在-5 和-4 mV 之间）。然而，βO2 包封效率（ 77%）要比 βN2 （91%）差，βO2 表观 pKa（5.5）也要比βN2 低（6.5）。所有其他酯类似物形成的 LNP 的 zeta 电位、包封效率及表观 pKa 与 Linker 碳原子数目之间呈现非常明显的正相关。增加 βO2 连接子长度，可将 LNP 的 zeta 电位从 -5 mV 增加到 -0.5 mV，mRNA 包封效率从 77% 增加到 96%，表观 pKa 从 5.5 增加到 6.6。这些结果表明，具有较高 pKa 的可电离脂质在配制过程中更擅长包封 mRNA，从而导致靠近 LNP 表面的 mRNA 分子更少，并且表面负电荷更少。
小鼠肌肉注射一系列 Fluc mRNA-LNP 六小时后，注射部位的荧光信号强度达到最高。与 SM-102、ALC-0315、MC3 相比，βO2 递送的 Fluc mRNA 表达水平明显偏低（三个数量级），相反，βN2 及βO2 的一系列酯类似物递送的 Fluc mRNA 表达水平并不是相差太多。具有较高表观 pKa 的βO2 酯类似物呈现更高的蛋白产量，最佳表观 pKa 为 6.4，δO3 是肌内 mRNA 递送最有效的酯类似物载体。hEPO 是一种分泌蛋白，肌肉注射βN2 或δO 3 LNP 包封的 hEPO mRNA，检测 hEPO 蛋白血清浓度，hEPO mRNA-δO 3 LNP 同样呈现出更加高水平的表达。
更快的脂质水解加速组织清除 LNP
δO3 的降解速度比 βN2 快，因为酯类通常比酰胺更易水解。βN2 的水解半衰期约为δO3 的 300 倍。向 CD-1 小鼠肌肉注射 hEPO mRNA-δO 3 LNP 或者βN 2 LNP，检测血清、肌肉、肝脏及脾脏中的可电离脂质含量。结果发现，与βN 2 LNP 相比，δO 3 LNP 在各个组织中的总体含量明显偏低，可以更加快速从各种器官和组织中代谢清除。
可离子脂质刺激全身炎症反应，影响细胞免疫反应
向 BALB / c 小鼠肌肉注射 hEPO mRNA-δO 3 LNP 或者βN 2 LNP，检测不同时间的炎性细胞因子血清内功度。结果显示，两种类型的 LNP 均触发急性炎症反应，其特征是 IL-6、CSF3、CXCL1、CCL2、IL-5 和 CXCL10 增加，并在 48 小时后恢复到基线。IL-6 是上调最多的细胞因子，βN2 触发的 IL-6 平均浓度比基线高 33 倍，δO3 触发的 IL-6 平均浓度比基线高 25 倍。总体而言，mRNA-LNPs 和空 LNPs 的细胞因子谱之间的惊人相似性表明，可电离脂质是全身炎症反应的主要驱动因素。含有 δO3 的 LNP 通常也比含有 βN2 的 LNP 具有较弱的炎症性，这可能是由于脂质生物降解性差异造成的。
LNPs 诱导的炎性细胞因子谱有助于反应原性，但也直接影响疫苗反应的类型和强度。在小鼠流感模型中，肌肉注射由βN2、δO3 或 SM-102 LNP 递送的 HA mRNA，结果发现，所有 LNP 都诱导了同样强烈的中和抗体反应。令人惊讶的是，δO3 和 βN2 都诱导了比 SM-102 更高的 HA 特异性的 T 细胞反应。尽管 δO3 诱导的炎性细胞因子谱低于 βN2，但它在流感模型中产生了相当或更好的疫苗免疫原性。这些结果表明，可电离脂质的化学性质对小鼠细胞免疫反应的影响大于体液免疫反应。
小结
这项研究目的是为小鼠肌肉注射 mRNA 疫苗，优化一系列新型的可生物降解离子脂质。这些脂质是通过用酯连接取代βN2 中的酰胺连接来设计的，以增强生物降解性。通过微调 Linker 长度，筛选到δO3 可电离子脂质，其肌内递送效率要比 βN2 和行业基准更高，使其成为最有效的可电离脂质之一。并且，建立了 LNP 表观 pKa 与肌内 mRNA 表达水平之间的关系。此外，研究人员发现增强可电离脂质的生物降解能够抑制炎症反应，使得δO3 比 βN2 从小鼠器官和组织中清除得更快，减少炎症细胞因子的释放，递送的 mRNA 也会表达更多的蛋白。因此，理想的可电离脂质应在将 mRNA 递送至胞质溶胶后立即降解，以尽量减少与疫苗反应原性相关的过度炎症反应。最后，还发现一个极为有趣的现象，电离脂质的化学性质对细胞免疫反应的影响要超过体液免疫反应。总之，设计易于降解的可电离脂质是提升 mRNA 疫苗免疫效果，是减少接种触发的炎症反应的一条极为有用的策略。
