10 月份，华中农业大学赵凌教授团队与斯微生物联合在 Emerging Microbes & Infections 发表文章：A single immunization with core-shell structured lipopolyplex mRNA vaccine against rabies induces potent humoral immunity in mice and dogs，他们开发了一款以 LPP 作为递送系统、编码狂犬病毒糖蛋白 G 的 mRNA 疫苗，单次低剂量免疫便可触发强大的体液免疫反应，中和抗体滴毒高于 WHO 规定的阈值。
近日，华中农业大学赵凌教授团队再次在 mBio 发表文章：Circular RNA vaccines with long-term lymph node-targeting delivery stability after lyophilization induce potent and persistent immune responses。他们开发出一种淋巴结靶向性的 circRNA-mLNP 疫苗平台，将其应用于狂犬病毒疫苗（circRNA-mLNP-G）和新冠病毒疫苗（circRNA-mLNP-RBD），均可触发强烈的免疫反应。circRNA 稳定性的提升，使得抗原表达时间延长。甘露糖修饰的 mLNP 与树突细胞表面的甘露糖受体靶向性结合，增强 DC 细胞摄取 LNP，使得抗原更多分布在淋巴结。同时，PEG 脂质的甘露糖修饰使得冻干前后的 LNP 物理特性几乎保持不变，且冻干过程不会影响组织靶向特异性和免疫原性。总的来说，circRNA-mLNP 疫苗平台代表了一种非常有前景的疫苗设计策略。
淋巴结靶向性的 circRNA-mLNP 疫苗平台
首先，我们来看看 mLNP-circRNA 应用于狂犬病毒疫苗和新冠疫苗时的免疫保护效果：
对于新冠疫苗来说，mLNP-circRNA-RBD （甘露糖修饰LNP）在初次免疫和加强免疫后触发的抗体反应（中和抗体和 IgG 抗体）明显强于 LNP-circRNA-RBD（普通维未修饰LNP）。
在疫 21 天后的攻毒试验中，肌肉注射 mLNP-circRNA-G 或 LNP-circRNA-G 疫苗（2μg）的小鼠存活率为 100%，注射 ITV(灭活疫苗,0.1μg) 的小鼠存活率为 80%。此外，mLNP-circRNA-G 疫苗免疫小鼠的大脑中基本上检测不到病毒，而 LNP-circRNA-G 免疫小鼠的大脑中可检测到低水平的病毒。
在免疫 6 个月后的攻毒试验中，接种 mLNP-circRNA-G 的小鼠 100% 存活，而 LNP-circRNA-G 免疫小鼠存活率为 80%，ITV 免疫小鼠存活率下降至 30%。
这些数据表明，使用 mLNP-circRNA-G 进行单次免疫可通过引发持久的体液反应来提供针对 狂犬病毒（RABV）感染的长期保护。
接下来，我们聊聊 circRNA-mLNP 疫苗平台的三大特色：
第一，选择 circRNA，延长抗原表达时间，促进体液免疫反应。
传统的线性 mRNA 很容易被体内的酶和免疫系统清除，因此，不稳定，半衰期短，一般只能实现 1-3 天的抗原表达。circRNA 没有游离末端，不容易被降解，更加稳定。据报道，在哺乳动物细胞中，circRNA 中位半衰期至少比其线性 mRNA 亚型长 2.5 倍。与线性 mRNA 相比，circRNA 蛋白翻译表达时间可持续接近 1 周，蛋白产量提升数百倍。选择 circRNA 实现更加持久的抗原表达，类似于病毒抗原的缓慢释放过程，从而可以更准确地模拟自然感染 。
circRNA 延长抗原表达，促进生发中心反应（GCs）。与 mRNA-G 相比，circRNA-G 免疫小鼠，不仅可触发更高滴度的抗体（IgG 和中和抗体），还可将抗体滴度峰值维系在相对较长的一段时间。
circRNA-G 延长抗原表达，增强体液免疫反应。
第二，选择淋巴结靶向性的递送系统，增强 DC 内化 LNP，使得抗原分布朝着淋巴转移。
甘露糖受体（MR）是先天免疫系统重要的模式识别受体和内吞受体，主要存在于树突状细胞和巨噬细胞的细胞膜表面。树突细胞可以通过甘露糖受体介导的内吞作用摄取纳米颗粒，因此甘露糖表面修饰的纳米颗粒（mLNP）优先与树突细胞结合。
与 LNP-circRNA-G 相比，树突细胞摄取的 mLNP-circRNA-G 比例更高，从而导致更高水平的抗原表达。在免疫小鼠体内，绝大部分LNP-circRNA-G （85.3%）分布在注射部位，而 mLNP-circRNA-G 的分布集中在注射部位和淋巴结。在 LNP-circRNA-G 免疫小鼠中，只有 7.56％的抗原位于淋巴结中，而在 mLNP-circRNA-G 免疫小鼠中，淋巴结中抗原分布的比例增加至 46.61％。也就是说，LNP 的靶向性甘露糖修饰会改变抗原在体内的生物分布，朝着淋巴结更多地迁移抗原。此外，将 LNP 替换为 mLNP 后，肝脏中抗原表达的比例从 6.12%下降到 0.28%，也就说淋巴结靶向性的 LNP 可最大限度减少抗原在肝脏中的积累。
甘露糖修饰 LNP 靶向淋巴结，改变抗原分布。
与未修饰 LNP 相比，甘露糖修饰 LNP 靶向树突细胞，促进其成熟。同时，延长抗原在淋巴结内的滞留时间，增强生发中心形成，触发更加强烈的抗体反应。LNP-circRNA-G 疫苗免疫小鼠后 24 小时，在滤泡树突状细胞 (FDC) 或 淋巴结中的其他位置只检测到很少的抗原表达，而 mLNP-circRNA-G 疫苗免疫小鼠后 24 小时，在滤泡树突状细胞中检测到大量的抗原表达。
引流淋巴结滤泡树突状细胞中抗原的分布和引流淋巴结生发中心反应
第三，冻干过程不影响甘露糖修饰 LNP 的物理特性和靶向性，mLNP-circRNA 疫苗免疫原性保持不变。
目前，越来越的研究表明冻干 LNP-mRNA 疫苗可以在室温下长期保存。将冻干的 mLNP-circRNA-G 疫苗在 4°C 下储存 24 周，再水化后，与新鲜制备的 mRNA-LNP 相比，理化特性（包封率、PDI、Zeta 电位及尺寸）未发生改变。而且，冻干存放 24 周的 mLNP-circRNA-G 免疫小鼠后，其靶向性、抗原表达及触发的抗体反应与新鲜配制的均无显著差异。
冻干后的 mLNP-circRNA-G 依旧保持组织靶向性和强效的免疫性。
小结
circRNA 和淋巴结靶向性 LNP 递送系统的结合，可以延长抗原表达，增加淋巴结中抗原的分布和滞留，促进树突细胞成熟，增强生发中心反应，促使产生更多的滤泡辅助 T 细胞、活化 B 细胞、特异性抗体分泌细胞、长寿命浆细胞 及记忆 B 细胞。相比未修饰 LNP 递送系统或者线性mRNA，mLNP-circRNA 平台可触发更加高效、更加长久的免疫反应。
