我们知道，saRNA（自复制 RNA）要比一般的线性mRNA来说长很多。对长度为 1500nt 的 mRNA 来说，其对应的 saRNA长度会达到 9500nt，这是因为在 saRNA 中存在两个开放阅读框：一个用来编码 4 个非病毒结构蛋白（NSP），另外一个才用来编码靶标基因。相比传统线性 mRNA 来说，saRNA 最为显著的优势就是以极低剂量实现更持久的表达。mRNA 编码蛋白表达持续时间仅仅为 3-4 天，然而，saRNA 编码蛋白表达时间可持续至 60 天。
saRNA 与 mRNA 均是通过体外转录反应（IVT）来合成。伦敦帝国理工学院的 Robin J. Shattock 教授曾利用DoE优化IVT反应体系，提升saRNA产量，发现 Mg2+浓度是影响 saRNA 产量的关键。然而，目前大部分对于 IVT 反应的优化，以小于 1500nt RNA 为合成产量为评估指标，得到 IVT 合成配方中各个组分的最优浓度范围和最适反应调节：
Mg2+浓度为 40-60mM 提升 mRNA 合成速率。
添加尿素（0.8-1.2M）、突变改造 T7RNA 聚合酶以及提升温度来降低 dsRNA 含量。
亚精胺（spermidine）可使 RNA 聚合酶从质粒模板上解离，作用于 RNA 合成的起始和延伸阶段，刺激转录反应。有研究表明低浓度亚精胺有利于 RNA 合成。
二硫苏糖醇（DTT）一种还原剂，保护酶免于氧化。有研究表明超过 10 mM DTT 不会改善较短 RNA 的合成。
有些研究发现 DMSO 可将转录效率提升高达 15%，然而，还有些研究发现 10% DMSO 对于 RNA 产量没有影响。有趣的是，有人还发现，对于小 RNA 分子，添加 DMSO 会导致全长转录本和流产转录本生成更快。
2024 年 3 月 9 号，加拿大不列颠哥伦比亚大学UBC Anna Blakney Lab 在 European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 发表文章：Effect of in vitro transcription conditions on yield of high quality messenger and self-amplifying RNA (点击末尾阅读原文可见)，他们采用 DOE 方法探索 IVT 反应中各个反应参数如何影响 mRNA 与 saRNA 的产量和质量（纯度），寻找合成短 mRNA 和长 saRNA 的最佳反应条件。
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随着温度从 20℃上升至 42℃，mRNA 产量一直处于增加趋势，同时，mRNA 纯度并未发生明显变化。相反，随着温度从 20℃上升至 42℃，saRNA 产量虽然也会增加，但是，saRNA 纯度在温度超过 32℃时急剧下降。也就是说，在 IVT 合成过程中，由于 saRNA 要比 mRNA 更长，更脆弱，因此，saRNA 对温度变化更加敏感。
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采用确定性筛选设计（ Definitive Screening Design）评估对 mRNA 与 saRNA 的质量产量造成关键差异的 IVT 参数。研究者对每个 RNA 分子进行了 25 次 IVT 反应，重复三次。这样做会显着减少运行的 IVT 反应数量。如果不采用确定性筛选设计，考虑到八个因素中的每一个都有三种可能的组合，那么要执行的反应总数将为 6,561 。
研究人员的最终筛选设计包括八个因素和三个响应变量，并使用标准最小二乘模型进行分析。筛选的目的是确定 IVT 成分（如亚精胺、二硫苏糖醇、醋酸镁）、反应时间、离液剂（尿素）、二甲基亚砜 (DMSO) 和 pH 值如何影响合成 mRNA/saRNA 的产量、纯度以及 dsRNA 形成。由于 42℃以上，saRNA 降解非常厉害，因此将合成温度最高为 37℃。saRNA 纯度应该＞50%，mRNA 纯度应该>70%。
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合成不同要求的 mRNA 与 saRNA 的最适配方
合成 mRNA 时，实现最佳质量*产量条件为：Mg2+ 浓度为 43.77 mM，温度为 37 °C，DMSO 浓度为 10 %，时间为 4 h。
合成 mRNA 时，最小化 dsRNA 形成的最佳反应条件为：将 DTT 增加至 40 mM，将亚精胺浓度降低至 2 mM，Mg2+ 浓度为 10mM，温度为 37℃，反应时间为 4h，同时，将 DMSO 浓度增加至 10%，缓冲液 pH 为 8。
合成 saRNA 时，实现最佳产量*质量条件为：反应时间需要延长至 4 小时，并在 37 °C 下运行，Mg2+ 浓度为 50.9 mM，DMSO 浓度为 10 %，DTT 浓度为 10 mM，亚精胺浓度为 2 mM，pH 为 7。
影响 saRNA 与 mRNA 产量*质量的因素
在本文考察的 IVT 反应参数中，对 mRNA 和 saRNA 产量影响最为显著的因素是 Mg2+ 和温度。无论是较短的 RNA，还是均长的 RNA，增加 Mg2+ 和温度可显著提升 RNA 产量。相比较而言，其他 IVT 成分对于增加 mRNA 产量来说没有明显影响。此外，研究者还发现增加 DMSO 浓度和延长反应时间会对 saRNA 产量产生积极影响。众所周知，DMSO 会降低 DNA 的解链温度并促进聚合酶的作用。在 IVT 中添加 DMSO 有可能会更进一步提高转录反应效率。
尽管从本研究初步的温度筛选来看，在低于 42℃下，mRNA 质量不会受到温度变化的显著影响。然而，降低反应温度依然会对 mRNA 质量有轻微提升。
有趣的是，本研究显示，合成高纯度 saRNA 所需的 IVT 反应条件是低浓度 Mg2+ 和低温，相反，mRNA 分子需要高 Mg2+浓度（49.6 mM）实现最佳产量和纯度，降低Mg2+浓度反而会产生低质量 mRNA。此前，已有研究表明 Mg2+是聚合酶活性的关键，并且最佳转录反应需要最佳转录反应需要 NTP浓度超过 Mg2+浓度 9 mM 。在此次筛选中，实现高质量或者高产量所需的最佳 Mg2+浓度是不相同的，并且，合成 mRNA 或者 saRNA 所需的最佳 Mg2+ 浓度也是不相同的。与 NTP 浓度 相比，实现高纯度 saRNA 的最佳Mg2+浓度是过量 2 mM，而为了获得高产量saRNA，则Mg2+浓度需要过量约 40 mM。
影响 dsRNA 形成的因素
在合成 mRNA 和 saRNA 的 IVT 反应体系中，Mg2+对 dsRNA 的形成也具有最为显著的影响。以前早有研究在合成 mRNA 反应中观察到类似效应 。对 saRNA 和 mRNA 来说，将Mg2+浓度从 40 mM 减少至 10 mM 会明显降低 IVT 反应中形成的 dsRNA，当然产量也会随之发生降低。非常有趣的是，pH、亚精胺、温度、DMSO 和时间对合成 mRNA 的 IVT 反应中的 dsRNA 形成有显著影响，然而，对合成 saRNA 的 IVT 反应中的 dsRNA 形成没有明显影响。在 mRNA 合成过程中，增加反应时间和 DMSO 会减少 dsRNA 副产物形成，但是，这样做不会对 saRNA 合成反应中的 dsRNA 副产物的形成产生明显影响。较高的温度 (37 °C) 对于减少 mRNA 合成反应中 dsRNA 形成是最佳的，但对 saRNA 合成反应中 dsRNA 的形成没有明显影响。此外，在 mRNA 和 saRNA 合成反应中，研究人员没有发现 dsRNA 副产物的形成与尿素浓度之间存在明显的相关性。在 0 ~0.8 M 浓度范围内，尿素对响应变量没有影响。好玩的是，在产生最少量 dsRNA 和最高纯度 RNA 的反应体系中均具有高尿素浓度 (0.8 M)。
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此研究针对高纯度、高产量及其双重组合筛选出各自对用的最优 IVT 反应体系。根据应用场景的不同，可选择不同体系的最优 IVT 反应。如果最终的 RNA 产品应用于基因疗法或蛋白质替代疗法，那么对 IVT 反应来说将需要形成更少的 dsRNA 和更高质量的转录本。然而，由于 dsRNA 具有免疫原性，对于 mRNA 疫苗来说，IVT 反应中 dsRNA 的形成可能是有益的。
先前有研究表明，在较高温度下，突变 T7 聚合酶对于减少 mRNA 合成反应中的 dsRNA 形成非常有效。然而，尚不清楚这种突变聚合酶是否也同样适用于 saRNA 合成，因为温度的升高会明显降低 saRNA 质量。另外一方面，低温和低 Mg2+ 浓度肯定会严重抑制 RNA 产量。
为解决 saRNA 合成中面临的高质量/低产量挑战，研究者认为可以从嗜冷微生物中提取 T7 聚合酶来改善 IVT 反应。有趣的是，此前有报道称，这种 T7 聚合酶可在 4 ~ 25 °C 下降低 mRNA 合成反应中的 dsRNA 含量 ，但尚不清楚它如何影响质量，因为 mRNA 的高质量与低 dsRNA 含量不存在相关性。
嗜冷噬菌体聚合酶或丁香假单胞菌 RNA 聚合酶也可能提高 saRNA 的质量和产量。还可以在 saRNA 合成的背景下探索 DNA 模板启动子区域序列修饰以实现与 T7 聚合酶的最佳结合亲和力。未来的 IVT 优化过程还应考虑 saRNA 和 mRNA 的不同质量要求。
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此前，IVT 产量和质量之间的关系尚未明确。这项研究通过 DOE 方法确定了短和长 RNA 转录本的最佳 IVT 条件。研究者观察到 saRNA 需要较低的温度和 Mg2+浓度才能产生高质量的转录本和最少的 dsRNA 副产物。然而，mRNA 质量不会受到相同程度的温度变化影响，并且需要高 Mg2+ 浓度才能实现高产量和高质量。上述观察结果对于以 saRNA/mRNA为基础的疫苗和药物的设计生产非常重要。
