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在 circRNA 原液合成中，产物相关杂质主要包括：线性 precusor RNA，circRNA 断裂而成的 nicked circRNA，掉落的 Introns，包含多个 CDS 的线性或者环状的串联高分子量RNA（HMW），circRNA 聚集体（Aggregates）。这些杂质的鉴定和分离一直是 circRNA 疫苗产业化过程的阵痛所在，尤其是一些具有相似分子量，不同结构的杂质分子，例如，circRNA 和 nicked RNA。2023 年 4 月份，美国药典（USP）发布了第二版《mRNA 疫苗质量分析方法》指南草案，涵盖线性 mRNA 整条生产线的分析方法，包括质粒DNA，mRNA 原液（Drug Substance），mRNA 制剂（Drug Product）。然而，WHO 和各国药监局尚未发布任何针对 circRNA 疫苗的质量分析指导草案。
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与线性 mRNA 相比，闭环的 circRNA 可避免核酸外切酶介导的降解，在哺乳动物细胞中表现出更长的半衰期，表达蛋白的持续时间也更长。可是，这并不意味着 circRNA 永远不会被降解，在体内也存在各种降解 circRNA 的酶促途径。目前，大家对于 circRNA 降解过程和降解产物的生物学功能并不是十分清楚。
正是鉴于上述原因，2024 年 7 月 1 号，中国食品药品检定研究院徐苗团队在 Chemosensors 发表文章：Study on the Characterization and Degradation Pattern ofCircular RNA Vaccines Using an HPLC Method，他们采用 RP-HPLC 来将 circRNA 和产物相关杂质成功区分开来，并且，对热加速降解条件下 circRNA 的降解模式以及降解产物的免疫原性展开研究。
基于 RP-HPLC 的 circRNA 纯度分析
采用 Qsep100 分析基于 I 型内含子合成的 EGFP circRNA 样品。未加入 RNase R 时，EGFP circRNA 合成液在 Qsep100 毛细管电泳图谱显示出两个峰。加入 RNase R 后，EGFP circRNA 酶切液在 Qsep100 毛细管电泳图谱只出现一个峰，紧挨的后峰消失。这说明加入 RNase R 不会发生降解的前峰是 circRNA，而加入 RNase R 发生降解的后峰是线性的 precusor RNA。Qsep100 毛细管电泳可以将 circRNA 与线性的 precusor RNA 区分开来，却无法将 circRNA 与 nicked circRNA 区分开来。![]()
在反相色谱中，分析物在极性流动相和非极性固定相之间分配。非极性（疏水性）分析物与固定相之间发生非特异性相互作用，保留更强。通常极性化合物先洗脱，非极性化合物后洗脱。研究人员采用 RP-HPLC 系统来分析 EGFP circRNA 合成产物：选择 AcclaimTM 300 C18 柱（3μm），柱温保持在 55℃，移动相 A 为 100mM TEEA（ 三乙胺乙酸盐缓冲液），移动相 B 为 5% 100mM TEEA 和 95% 乙腈，流速 0.3mL/min。结果发现，在 RP-HPLC 色谱上，circRNA，Nicked RNA，Precusor RNA 非常明显地分离开来。
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基于 ICH Q2(R2)分析方法验证指导原则，研究人员对 RP-HPLC 分析 circRNA 的专属性，检测限，定量限及精密度展开验证。专属性测试显示溶剂对 RNA 的检测形成干扰。circRNA，Nicked circRNA，Precusor 的检测限分别是 2.4、1.7、1.7ng/μL，而定量限分别是 7.1、5、5ng/μL。而且，多个检测人员检测多个 circRNA 样品的纯度分析结果偏差仅仅是 0.6%。上述验证结果表明采用 RP-HPLC 分析和鉴别 circRNA 和 Nicked circRNA 完全是可行的。
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此外，虽然 RP-HPLC 选用的色谱柱温度要求 55℃，但是，与未加热对照组相比，将 circRNA 样品置于 55°C 下的流动相并不会引起 RP-HPLC 色谱峰图的显著变化。
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最后，鉴于 USP 指导原则中采用 SEC-HPLC 分析线性 mRNA 聚集体，研究人员证实采用 SEC-HPLC 也可分析和定量 circRNA 样品中的聚集体。![]()
circRNA 降解模式
根据 ICH 稳定性研究指南，将基于 RP-HPLC 纯化制备的 circRNA 样品至于不同存储温度下进行热加速稳定性测试。
RP-HPLC 结果显示：circRNA 在 4℃和 25℃存放一周后开始降解，在 37℃存放一天后开始降解。在 Nicked circRNA 产生过程中，其比例从 15%上升至 30%，增加存放时间会使其比例更进一步提升至 40%。随后，Nicked circRNA 比例开始下降，而 RNA 降解片段比例从 10%增加至 60%。也就是说，circRNA 在热加速实验中展现出来的降解模式是：circRNA→Nicked→RNA 降解片段。![]()
利用 SEC-HPLC 分析不同温度下存放的 circRNA 样品。在 4℃和 25℃条件下，circRNA 随着存放时间的增加，聚集体和 circRNA 比例均发生下降，而 RNA 降解片段比例出现增加（9%~80%）。有意思的是，在 37℃条件下，随着存放时间的增加，circRNA 比例下降，RNA 降解片段比例出现增加，而聚集体比例会先增加降低。整体来看，SEC-HPLC 结果表明 circRNA 样品在不同温度存放过程中，circRNA 和聚集体的降解伴随着 RNA 降解片段的形成。![]()
circRNA 及杂质的表达活性。
研究人员纯化分离收集 EGFP circRNA、Nicked circRNA、聚集体、降解片段及 precursor RNA，转染 A549 细胞，采用流式和荧光共聚焦扫描显微镜检测上述成分各自的 EGFP 表达活性。从转染后 24h~72h，circRNA 表现出持续的、增加的 EGFP 蛋白表达水平。precursor RNA 和降解片段根本不表达 EGFP 蛋白。Nicked circRNA 和聚集体表现出极低的 EGFP 蛋白表达水平（分别为 circRNA 荧光强度的 1/5 和 1/20）。![]()
circRNA 及杂质的免疫原性
采用 LNP 包封未纯化/纯化 EGFP circRNA、Nicked circRNA、聚集体、降解片段及 precursor RNA。分别向小鼠体内肌肉注射 10ug 上述 RNA 制剂，测定血清中的炎症细胞因子和 EGFP lgG 水平。注射 12h 后，与空壳 LNP/PBS（190 和 2pg/mL）相比，注射 circRNA 及其杂质 RNA 制剂的小鼠血清中促炎细胞因子水平明显升高很多（3200~5700pg/mL）。与细胞水平 EGFP 表达相似，precursor RNA 和降解片段 LNP 制剂注射组血清中未检测到 EGFP lgG。直接从 IVT 中获取的未纯化 circRNA 和纯化 circRNALNP 制制剂注射组小鼠血清中可检测到很高的 EGFP lgG 滴度，而 Nicked circRNA 和聚集体 LNP 制剂注射组血清中的 EGFP lgG 滴度要降低很多。![]()
circRNA 及杂质激活的模式识别受体
既然 circRNA 及其产物相关杂质均会明显触发细胞释放促炎细胞因子，那就很有必要搞清楚它们各自激活的细胞模式识别受体是否有区别？将 EGFP circRNA 及其产物相关杂质分别转染特定的模式识别受体报告基因细胞。与野生型细胞相比，敲除 RIG 基因导致 circRNA 触发的荧光水平降低，敲除 TLR3/8 导致 Nicked circRNA 触发的荧光水平降低，敲除 TLR7/8 导致聚集体和降解片段触发的荧光水平降低，敲除 TLR3 导致 precursor RNA 触发的荧 光水平降低。![]()
小结
目前，监管机构缺乏关于 circRNA 疫苗的质量控制研究的指导文件。circRNA 原液合成中会出现好几种产物相关的杂质，而且，这些杂质与 circRNA 之间的区分度不是很好。这项研究建立的 RP-HPLC 纯度分析方法可以很好地将 circRNA 与 Nicked circRNA 区分开来。同时，还发现在热加速稳定性实验中，circRNA 降解模式为:circRNA→Nicked→RNA 降解片段。更加重要的是，这项研究在细胞水平和小鼠体内检测了 circRNA 及杂质 RNA 的蛋白表达水平和免疫原性，发现只有 circRNA 表达水平和表达时间最长，circRNA 及杂质 RNA 还会强烈触发促炎因子的释放，在细胞内拥有不同的模式识别受体。关于 circRNA 及杂质的分析，旧文也曾数次提及，不同的分析方法，circRNA 及杂质出现的位置均是不相同的，很容易让人混淆。我们在这里总结归纳如下：- 在 Qsep100 毛细管电泳中，circRNA 迁移速度＞Precusor RNA，因此，peak 1 为 circRNA，peak 2 为 Precusor RNA，circRNA 与 Nicked cirRNA 无法区分开。
- 在天然琼脂糖凝胶电泳中（Agarose），circRNA 迁移速度＞Precusor RNA，在胶图上面的条带是 Precusor RNA，下面的是 circRNA，circRNA 与 Nicked cirRNA 无法区分开。
- 在尿素变性 PAGE 凝胶电泳中，Precusor RNA 迁移速度＞circRNA，在胶图上面的条带是 circRNA，下面的条带是 Precusor RNA。
- 在 Thermo Fisher 预制胶 E-Gel EX 电泳系统中，circRNA 在电泳胶图中呈现的表观 Size 远超过其实际 Size，电泳条带分布：circRNA>Precusor RNA> Nicked RNA。需要特别注意的是，在 E-Gel EX 电泳系统中，circRNA 迁移速率会受到上样缓冲 buffer，染料，电压的影响。
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